复合PRP与BMP-4的Nano-HA并髓心减压治疗兔股骨头坏死

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(1 青岛大学附属医院关节外科,山东 青岛 266003; 2 青岛市市立医院肾内科)

目前，股骨头坏死临床发病率越来越高，晚期股骨头坏死的主要治疗方法为髋关节置换，虽然该技术已较为成熟，但仍存在假体使用年限有限等缺点，因此临床治疗中尽量保留股骨头很有必要。髓心减压术是保留股骨头的手术治疗方法之一，可通过减少淤血降低髓内压力从而促进新生血管形成。近年来，随着组织工程学和基因工程技术的快速发展，人们发现富含血小板血浆(PRP)含有多种生长因子，可促进新生骨形成[1]；骨形态发生蛋白(BMP)可参与调节细胞生长、繁殖、分化和凋亡，而其主要的生物学作用是诱导骨形成[2]。本实验应用BMP-4协同PRP搭载纳米羟基磷灰石(Nano-HA)联合髓心减压术修复兔股骨头坏死，并且通过组织学观察及骨密度检测探讨其修复股骨头坏死的可行性。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 股骨头坏死模型的制备及分组

健康6月龄新西兰大白兔40只，体质量2～3 kg，雌雄不限，每周2次臀肌注射醋酸泼尼松龙，每次8 mg/kg,连续6周,制备股骨头坏死模型。同时，每周2次肌肉注射青霉素钠4万单位以预防感染。模型制备成功后取36只大白兔，随机分为A、B、C共3组，每组12只，在相同条件下饲养。

1.2 含PRP与BMP-4活性Nano-HA材料的制备

①采用低密度两次离心法制备PRP：使用装有100 g/L枸橼酸钠溶液0.5 mL的注射器从兔耳中央动脉采集血液，将其摇匀，分别以2 400 r/min离心10 min、3 600 r/min离心15 min, 制备PRP后置-70 ℃冰箱冻存。 ②将80 mg粉末状BMP-4 溶于2 mL无菌生理盐水中，并加入PRP 0.6 mL制备混合溶液, 混匀，将Nano-HA材料浸泡于该溶液中混合塑形，然后于真空冻干机中冻干48 h，60Co辐照消毒，无菌封装，备用。

1.3 实验方法

B组和C组大白兔耳缘静脉麻醉后，股骨头区域常规消毒，铺无菌单，切开皮肤，暴露股骨头，用直径约3 mm的钻头从股骨颈后内侧向股骨头内钻入3 mm行髓心减压术，B组髓心减压术后逐层缝合，关闭切口；C组髓心减压术后植入一约3 mm×3 mm×3 mm大小、含PRP与BMP-4的Nano-HA，缝合关闭切口。术后连续3 d肌注青霉素(每天20万单位)预防感染。A组不做任何处理。

1.4 观察指标

1.4.1一般情况 实验期间观察大白兔进食、活动、切口愈合等一般情况。

1.4.2组织学观察 术后2、4、8周每组均处死3只兔，切取股骨头，沿冠状面剖开，置于40 g/L 多聚甲醛溶液中固定,脱钙液脱钙，石蜡包埋、切片，行苏木精-伊红(HE)染色, 光镜下观察新骨形成情况。

1.4.3骨小梁图像分析 取B、C组术后2、4、8周股骨头切片， 100倍显微镜下取5个视野，应用图像分析系统测定骨小梁占骨缺损面积比例，取平均值。

1.4.4骨密度测定 术后8周切取3只兔股骨头，应用单光子骨密度测量仪测量股骨头骨密度，测量位置为股骨头冠状面中部，测3次，取平均值。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大白兔一般情况

术后2 d各组大白兔进食均较少，精神状况较差，2 d后进食逐渐增加至正常水平，活动增加。3组大白兔切口均愈合良好，未见明显炎性反应。

2.2 各组组织学观察

A组：术后2周，大量骨细胞及骨髓组织坏死，髓腔中充满坏死的组织碎片，骨小梁坏死、断裂，可见大量骨陷窝；术后4周，缺损边缘可见少量新生骨及纤维肉芽组织；术后8周，周边有骨组织形成，中心为纤维组织，无骨组织充填。B组：术后2周，骨缺损区可见少量炎性细胞，缺损边缘可见成骨细胞，并有少量骨小梁出现；术后4周，骨缺损边缘区成骨细胞及骨小梁增多；术后8周，缺损边缘逐渐形成骨壁，缺损区仍然在修复，可见大量的骨髓组织。C组:术后2周，骨缺损区充满大量的成骨细胞，边缘区可见新生骨小梁；术后4周，股骨头内大量骨小梁形成，骨小梁表面有成骨细胞覆盖，小梁间新生毛细血管丰富；术后8周，骨缺损区基本消失，可见大量成熟的骨小梁充填其中，骨髓组织形成。

2.3 B组、C组骨小梁占缺损区面积比例比较

术后2、4、8周，C组骨小梁占缺损区面积比例均高于B组，差异有显著性(t=2.459～2.949,P<0.05)。见表1。

表1 B组、C组术后各时间点骨小梁占缺损区面积比例

2.4 各组骨密度比较

术后8周，A、B、C组骨密度分别为(0.334±0.024)、(0.388±0.021)、(0.445±0.032)g/cm2，C组骨密度高于A组和B组，B组高于A组，差异均有显著性(F=13.655,P<0.05)。

3 讨 论

目前,股骨头坏死已经成为临床中较为常见的疾病，股骨头一旦坏死，难以自身修复，这主要与其自身血液循环较少、新骨形成缓慢但骨小梁吸收过快等有关。因此，促进新生血管与新骨形成是早期股骨头坏死治疗的关键。本文组织学观察结果显示，B组4周及8周时具有一定的骨小梁修复骨坏死及促进新生骨形成的能力，其基本原理是通过降低股骨头内压力，延缓骨坏死进展，刺激周围血管形成，从而提高股骨头的血流量以改善血液循环,增强骨修复时的爬行替代，较快修复坏死灶。目前，髓心减压术治疗股骨头坏死已经被证实有效、可靠[3]。本文研究结果显示，B组虽然进行了髓心减压，组织学观察显示也有骨小梁的修复及新生骨的形成，但由于股骨头坏死区周围缺乏促进骨修复的生长因子，导致股骨头修复不完全。本实验C组同时将含PRP与 BMP-4的Nano-HA植入髓心减压后的坏死股骨头中，组织学观察表明术后4周即有明显的成骨反应，并有明显的新生骨形成；术后8周组织学观察及骨密度检测结果表明，C组的骨修复能力明显好于B组，认为与PRP及BMP的骨诱导作用及良好的支架材料对两种生长因子的理想搭载有关。

随着组织工程技术的发展，PRP促进骨缺损修复正逐渐成为研究热点，PRP在骨缺损的修复治疗方面取得了很好的效果[4]。PRP能增强体内成骨愈合，其机制可能为：活化血小板释放多种生长因子,如血小板源生长因子(PDGF)、类胰岛素生长因子(IGF)、转移生长因子-β(TGF-β) 等[5]，其中PDGF能促进细胞的有丝分裂，促进新生血管形成[6]；IGF可调整成骨细胞与破骨细胞的分化[7]；TGF-β能诱导成骨细胞分化、促进新骨形成[8]。PRP中含有的各种生长因子符合人体的比例，因此成为临床应用中的理想生长因子来源。BMP是目前已知的确定具有骨诱导功能的生长因子[9]。关于BMP在骨形成中的作用机制主要集中在以下两个方面：①募集间充质细胞并诱导其向成骨细胞分化；②联合其他生长因子共同参与骨组织的形成[10]。有研究结果显示，BMP的作用与距离呈反比，当骨缺损超过一定范围时，机体自身的BMP已经难以起到诱导骨形成的功能，因此适当补充外源性的BMP十分必要。随着组织工程技术的发展，人们已经研制出了活性高、成本低的BMP,这使得外源性BMP的来源问题得到了解决。

PRP与BMP本身无固定与支撑功能，植入体内骨缺损部位后容易被扩散稀释或吸收降解，难以持久地在骨缺损处发挥作用。因此，寻找一种生物相容性较好的材料一直是材料学与临床医学领域的一项重大研究任务。本文组织学研究结果显示，Nano-HA具有良好的生物活性，具有诱导成骨活性的能力，新生的组织中含有促进骨形成的生长因子及具有成骨潜能的细胞，而且该材料具有较高的比表面积，容易吸收，在新骨形成的同时逐渐降解[11]，并被新生的骨组织替代。其具有的多孔结构使得成骨细胞生长时容易爬行附着，骨缺损的爬行替代过程缩短，并能够为新生血管及生长因子提供附着支撑。同时，本文组织学观察未见明显炎性反应，说明Nano-HA有良好的生物相容性。已有研究结果证实，Nano-HA对细胞无毒性，是一种理想的骨移植替代材料[12]。

本文研究结合了组织工程治疗与外科治疗的优点，应用髓心减压术减轻骨内高压与静脉淤血，促进了股骨头的血液循环；通过生长因子的植入，提高了骨修复的能力，加速了骨的形成过程，这为临床上早期股骨头坏死的治疗提供了新的思路。但本文研究中也有一些需要进一步研究的地方，如无法证实生长因子的浓度与骨诱导的关系。希望今后能对此进行研究并确定生长因子作用的最佳浓度。

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