利用基因芯片法检测鸟分枝杆菌

史新辉,王 芳,龙宇鹏，方 丽

鸟分枝杆菌病是由鸟-胞内分枝杆菌复合体(Mycobacteriumaviumcomplex,MAC)[1]感染引起的人兽共患性传染病,早期症状不明显,多是发展到中后期通过胸部X光片或CT检查才被发现[2]。目前,临床多采用抗酸染色、培养法来检测[3]。抗酸染色操作简便,但灵敏度不高,不能鉴定细菌种类,只能作为初筛手段；培养法可以进行鉴定及药敏试验,是目前微生物鉴定的最有效和常用的方法。但分枝杆菌培养一般需要7～14 d才可出结果,容易延误临床诊断。与培养法相比,基因芯片法[4]检测时间短、通量高,可以将检测时间缩短为6 h左右。因此,本研究利用PCR扩增和基因芯片方法检测鸟分枝杆菌,现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1材料与设备 标准菌株购自上海天呈医疗有限公司,包括鸟分枝杆菌(ATCC 25291)、结核分枝杆菌(ATCC 27294)；基因芯片杂交盒、PCR扩增仪及基因芯片扫描仪(北京博奥生物有限公司),N-乙酰-L-半胱氨酸(美国SIGMA公司),引物及探针合成(上海生工生物公司),细菌DNA提取试剂盒、PCR扩增试剂及基因芯片杂交试剂(北京博奥生物有限公司),分枝杆菌快速变色液体培养基(广州凯升生物科技有限公司)；CO2培养箱(美国SHELL/B公司)。

1.2标本采集 痰液标本来源于2012年9月～2013年12月本院95例疑似分枝杆菌属感染患者。

1.3基因芯片检测

1.3.1PCR引物、探针的设计与合成 设计软件:Primer Premier 5。设计遵循以下原则:引物与非特异性序列的同源性不要超过70%或有连续6个互补碱基同源；Tm值接近72 ℃；引物自身及引物之间不互补,避免3′端的互补重叠。设计出的PCR引物交由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3.2细菌DNA提取 痰液标本中加入1～2倍标本体积的稀释液,振荡15～20 s,室温放置15 min；组织标本:加入能完全浸没组织标本的稀释液,振荡15～20 s,室温放置24 h。取痰液底层1.5 ml至EP管中,每个标本平行3份。12 000 r/min离心5 min,弃上清。取第1份,加入1 ml蒸馏水；剩余2份均加入200 μl蒸馏水,用加样枪吹吸2次后,移入第1份EP管中,12 000 r/min离心5 min,弃上清。加入80 μl核酸提取试剂,放入核酸快速提取仪,振荡5 min；移入核酸提取管后,于95 ℃水浴5 min取出,5000 r/min离心1 min。

1.3.3PCR扩增 PCR扩增体系:10×buffer 2 μl；0.2 μM dNTP 2 μl；Taq酶 0.5 μl；10 μM primer(F+B)2 μl；DNA模板 2 μl；蒸馏水13.5 μl(总体积20 μl)。PCR扩增条件:94 ℃,5 min；(94 ℃,30 s；50 ℃,30 s；72 ℃,40 s)循环40次；72 ℃,7 min。

1.3.4探针杂交 6 μl PCR扩增产物与9 μl杂交缓冲液混合,94 ℃解链5 min,立即置入冰盒中冷却3 min；用微量移液器吹吸2次混匀。经杂交盒盖片的加样孔加入13.5 μl的杂交反应混合物。取10 μl含相应探针的杂交液滴于芯片上。盖上杂交盒并密封,放入50 ℃预热的恒温水浴锅,水浴120 min。取出芯片,用平衡至室温的芯片洗液Ⅰ在恒温摇床上以80～100 r/min的转速洗涤3 min。然后用芯片洗液Ⅱ在同样条件下洗涤3 min，以800 r/min的转速离心5 min。

1.3.5基因芯片检测 使用LuxScan 10K-B微阵列芯片扫描仪对甩干后的芯片进行扫描,通过软件判读结果,采集图像并分析检测报告。

1.4细菌培养法检测 取痰液标本2 ml,加等量2%～4%的NALC-NaOH消化液,振荡30 s,室温放置15 min；加入pH 6.8的PBS缓冲液至45 ml,混匀；以10 000 r/min离心10 min,倾去上清液；洗涤沉淀1次。接种0.1 ml于分枝杆菌快速变色液体培养基中,37 ℃培养1～6 w。结果判断:接种后第1 w每天观察,当培养基颜色变紫色或紫红色,或底层有紫色颗粒状沉淀时,取培养基1滴于载玻片上,抗酸染色；如发现抗酸杆菌,报告阳性；再通过Vitek-Ⅱ细菌培养鉴定仪鉴定到菌种。阴性则继续培养,直到第6 w,培养基仍没有变紫色或紫红色,培养瓶底层也没有紫色颗粒状沉淀,则报告“未培养出分枝杆菌”。

1.5统计学方法 采用SPSS18.0软件分析,数据采用株和百分率表示,率的比较采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。以培养法为参考方法,比较基因芯片检测的灵敏度、特异性及与培养法检测结果的符合度。

2 结果

2.1PCR扩增引物的设计 通过筛选,选择鸟分枝杆菌IS1245特异序列(GenBank:L33879.1)为靶基因,Primer Premier 5.0软件设计PCR扩增引物,并已在NCBI/BLAST检索其特异性,符合设计要求。引物设计结果见表1。

表1 鸟分枝杆菌PCR扩增引物设计

2.2基因芯片检测 检测结果显示(图1),基因芯片检测方法能够对鸟分枝杆菌进行特异性检测,对呼吸道感染中常见的干扰菌均无扩增,表明该检测方法有较好的特异性。

图1 鸟分枝杆菌的基因芯片检测结果

2.3两种方法检测结果比较 以细菌培养法为参考方法,培养法检出鸟分枝杆菌5例,基因芯片检测出4例,基因芯片法的灵敏度为80.0%；培养法检出其他菌株及阴性样品89例,基因芯片检出阴性88例,特异性为98.9%；基因芯片法与培养法的总体符合率为97.9%,两种方法的检测符合率无显著性差异(P>0.05,表2)。

表2 两种方法检测结果比较(例)

3 讨论

人感染MAC后,可侵害多种组织器官,包括肺、骨髓和淋巴结等,引起相应的组织器官感染[5]。鸟分枝杆菌的快速检测,对预防及治疗鸟分枝杆菌病都有重要意义[6]。但分枝杆菌生长缓慢,用传统诊断技术周期长、敏感性低、容易延误患者病情的诊断[7],因此,研究快速检测鸟分枝杆菌的方法十分必要。

基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上,可以一次性对大量样品序列进行检测和分析,从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。与传统检测方法相比,基因芯片法检测时间短、通量高[8]。

本研究采用鸟分枝杆菌IS1245特异序列为靶基因,Primer Premier 5.0设计PCR引物,并在NCBI中检索了特异性,在此基础上进行基因芯片法检测,并与目前临床上常用的细菌培养法进行了比较。结果发现,以细菌培养法为参考方法,基因芯片灵敏度为80.0%,特异性为98.9%,总体符合率为97.9%,两种方法无显著性差异(P>0.05)。本次研究结果表明,基因芯片检测鸟分枝杆菌的方法,灵敏度高、特异性好,与细菌培养法结果一致,检测周期短(1～2 d),有望用于鸟分枝杆菌的临床快速检验。

【参考文献】

[1] Ohara N,Ohara-Wada N,Kitarua H.Analysis of the genes encoding the antigen 85 complex and MPT51 fromMycobacteriumavium[J].Infection and Immunity,1997(9):3680-3685.

[2] Kim TS,Koh WJ,Han J.Hypothesis on the evolution of cavitary lesions in nontaberculous myeobaeterial pulmonarty infection:thin-section CT and histopathologic correlation[J].American Journal of Roentgenology,2005,184(4):1247-1252.

[3] 段鸿飞,土井敦生,李琦.鸟分枝杆菌复合群对16种抗感染药物药敏试验的分析[J].中华结核和呼吸杂志,2010(5):359-362.

[4] Jack PJM,Amos-Ritchie RN,Reverter A.Microarray based detection of viruses causing vesicular or vesicular-like lesions in livestock animals[J].Veterinary Microbiology,2009,133(1-2):145-153.

[5] Marras TK,Wallace RJ Jr,Koth LL.Hypersensitivity pneumonitis reaction toMycobacteriumaviumin household water[J].Chest,2005,127(2):664-671.

[6] 中华医学会结核病学分会.非结核分枝杆菌病诊断与处理指南[J].中华结核和呼吸杂志,2000(11):650-653.

[7] Griffith DE,Brown-Elliott BA,Langsjoen B.Clinical and molecular analysis of macmlide resistance inMyeobacteriumaviumcomplex lung disease[J].American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine,2006(8):928-934.

[8] 崔振玲,景奉香,胡忠义.基因芯片检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药性研究[J].中华结核和呼吸杂志,2004(7):439-441.