乳酸菌拮抗食源性致病菌研究进展

石金鑫，白凤翎，吕欣然，杜静芳，励建荣

（渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁省食品安全重点实验室，“食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心”辽宁省高校重大科技平台，辽宁锦州 121013）

世界范围内，食源性致病菌是引起食品安全事件的主要风险因素之一。2010年8月，美国发生肠炎沙门氏菌鸡蛋感染事件，导致各州共1600余人染病，召回5.5亿枚可能污染沙门氏菌的鸡蛋[1]。2011年5月，德国因“毒芽菜”爆发大肠杆菌O104∶H4疫情，共感染4125人，造成48人死亡[2]。据流行病学调查估计，2010年美国感染大肠杆菌O157∶H7的总人数达3268人，其中住院率和死亡率分别为46.2%和0.5%[3]。据世卫组织专家估计，发展中国家食源性疾病状况可能更严重，每年由食源性致病菌引起的细菌性腹泻大约导致180万儿童死亡[4]。因此，控制食品中致病菌对于保障食品安全具有重要的意义。食品中致病菌的控制方法包括物理法、化学法和生物法。物理法主要采取低温、干燥、加热和辐照等方式，这些方法往往会改变食品的性质和感官品质。化学防腐剂不仅会在食品中产生药物残留，同时也会使致病菌产生耐药性[5]。相比而言，生物控制技术具有安全、高效以及对食品损伤小的特点，如乳酸菌素Nisin、ε-多聚赖氨酸、茶多酚等生物防腐剂在食品领域广泛应用并取得良好的效果。乳酸菌是传统发酵食品中重要的微生物类群，在发酵过程中形成酸性代谢产物和低pH环境限制了微生物的生长，不仅赋予产品特殊的品质，而且使产品更具有安全性。以乳酸菌及其代谢活性物质作为生物保护剂（bio-protective agent）控制食品中腐败微生物和致病菌在食品领域已广泛应用[6]。本文对乳酸菌生物保护剂的拮抗作用机制，对食源性致病菌的控制作用及在食品领域中的应用进行综述，为挖掘乳酸菌生物资源、利用乳酸菌生物制剂控制食源性致病菌研究与应用提供借鉴和参考。

1 乳酸菌生物保护剂

1.1 乳酸菌的抗菌作用

乳酸菌发酵食品之所以能够保持良好的产品品质和较长的保藏期，是因为乳酸菌及其发酵产物具有较强的抑菌作用。乳酸菌拮抗他种微生物生长的机制主要通过生态位竞争、酸性环境和拮抗代谢产物等方式。首先，乳酸菌以其特殊的生态位率先利用营养物质，占据生长优势地位，抑制他种微生物的生长[7]；其次，乳酸菌发酵形成大量乳酸、乙酸、丙酸等酸性物质形成酸性环境，限制了大多数微生物的生长繁殖；第三，乳酸菌发酵产生各种抗菌产物，如乳酸菌素、罗伊氏菌素、环二肽、过氧化氢、双乙酰、二氧化碳等，以及苯乳酸、羟基苯乳酸、羟基脂肪酸等抗真菌代谢产物，这些物质对细菌、霉菌和酵母具有较强的拮抗作用[8-9]。

1.2 乳酸菌生物保护剂的特点和优势

乳酸菌广泛地存在于自然界中，相对于其他的生物保护剂，具有以下的特点和优势：一是乳酸菌广泛存在于发酵食品中，被美国FDA认证为GRAS（generally recognized as safe）生物制剂，具有安全性特点[10]；二是乳酸菌对细菌、真菌都具有抑制作用，具有抗菌谱广的优势[11]；第三，相对其他防腐方法，乳酸菌及其制剂还具有无损食品感官品质、无残留等特点[12-13]。因此，乳酸菌生物保护剂在食品中具有广阔的应用前景。

2 乳酸菌对食品中致病菌的拮抗作用

2.1 革兰氏阳性致病菌

通过食品引起人类食源性疾病的革兰氏阳性菌主要包括单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、肉毒梭菌和产气荚膜梭菌等[14]，这些细菌通过污染肉禽蛋类、海产品、乳制品和蔬菜类食品从而导致严重的食物中毒等食源性疾病。

2.1.1 单增李斯特菌 李斯特菌在自然界分布广泛，腐烂植物、土壤、动物粪便、青贮饲料和水中都可被发现，它们能够在很宽的温度（1～45℃）和pH（4.1～9.6）范围生长。其中，单增李斯特菌可污染原料乳、奶酪、冷冻肉类和家禽，海产品以及水果蔬菜等引起人类的食源性疾病[15]。研究表明乳酸菌对单增李斯特菌具有较强的拮抗活性，Koo等将Lactobacillus animalisLa51、Lb.amylovorusM35和Pediococcus acidilacticiD3三株乳酸菌按照1∶1∶2比例混合制成109CFU/g的生物制剂Lactiguard®，以Lactiguard®对发酵香肠中的单增李斯特菌进行拮抗作用研究，接种8周后烟熏香肠中的单增李斯特菌的数量减少了2～3个数量级，其中发挥主要作用的为乳酸菌无细胞上清液[16]。

2.1.2 金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌污染猪肉、牛肉、鸡肉、鸡蛋和焙烤食品等产生肠毒素引起人类的食物中毒。由于葡萄球菌代谢的特点，在食品中不能与正常的微生物群落进行有效地竞争，因此，可引入乳酸菌控制食品中金黄色葡萄球菌生长。Drosinos等在希腊南部自然发酵香肠中分离到300株乳酸菌和4株葡萄球菌，其中Lb.plantarum、Lb.cheese和Lb.rhamnoses是优势乳酸菌群，葡萄球菌分别是Staphylococcus simulans、Stap.xylosus、Stap.gallinarum和Stap.cohnii。进一步研究发现在香肠发酵的后期已经检测不到葡萄球菌，说明乳酸菌在发酵过程中完全控制了葡萄球菌生长[17]。Raccach等应用Lb.plantarum和Ped.cerevisiae在15℃下对煮制机械脱骨鸡肉中金黄色葡萄球菌进行控制研究，发现7d后金黄色葡萄球菌由对照组的107CFU/g降低到103CFU/g数量级，抑制效果显著[18]。Karska-Wysocki等利用Lb.acidophilusCL1285®和Lb.caseiLBC80R混合菌液对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株ATCC 4330进行琼扩实验，在37℃下24h后99%菌株ATCC 4330的生长受到抑制，表明乳酸菌对产生耐药性金黄色葡萄球菌也有较强的拮抗作用[19]。

2.1.3 蜡样芽孢杆菌 蜡样芽孢杆菌广泛地分布于土壤、水以及动物肠道等自然环境中，一般通过米饭等淀粉质食品引起人类食物中毒，细菌产生肠毒素，中毒者症状为腹痛、呕吐、腹泻[20]。Yang等将103CFU/mL蜡样芽孢杆菌YSP-A3-2添加至含有8.0×105CFU/mL乳酸菌的发酵米粉中，72h后YSP-A3-2的数量从103CFU/mL降至102CFU/mL，而乳酸菌数量却从8.0×105CFU/mL升至4.0×108CFU/mL，表明乳酸菌生长发酵的同时，显著地限制了蜡样芽孢杆菌的生长[21]。

以上的研究表明乳酸菌对革兰氏阳性致病菌具有显著的抑制作用，其中乳杆菌、片球菌、乳球菌和肠膜明串珠菌等对单增李斯特菌的作用效果较好，乳杆菌和片球菌等对金黄色葡萄球菌有抑制作用，来自发酵米粉的乳酸菌可有效控制蜡样芽孢杆菌的生长。

2.2 革兰氏阴性致病菌

食品中的革兰氏阴性致病菌主要包括埃希氏大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、空肠弯曲杆菌、副溶血弧菌等，它们存在于自然环境中，通过污染肉类、蛋类、乳类、果蔬、水产品引起人类的食源性疾病。

2.2.1 肠道致病菌 肠道致病菌主要包括沙门氏菌、埃希氏大肠杆菌、志贺氏菌和结肠炎耶尔森氏菌等，可通过人和动物粪便、肥料、灌溉用水污染农产品，也可在加工过程中污染各类食品引起人类的食源性疾病。其中，沙门氏菌和大肠杆菌O157∶H7引起的食物中毒占有较高的发病率和致死率。Cálix-Lara等将108CFU/g的乳酸菌制剂LactiGuardTM喷雾接种到含有102CFU/g 大肠杆菌O157∶H7和104CFU/g肠炎沙门氏菌的菠菜叶表面，在7℃12d后大肠杆菌O157∶H7和肠炎沙门氏菌的数量分别减少了101.6CFU/g和101.9CFU/g，表明LactiGuardTM可抑制两种肠道致病菌的生长[22]。Mufandaedza等将从津巴布韦传统发酵酸奶分离的乳酸菌Lc.lactisC1和酵母Candida kefyr23制成混合制剂C1/23，分别添加发酵乳CH-N 22中对Escherichia coli和Salmonella enteritidis进行抑制研究，发酵48h后，添加C1和C1/23的E.coli3339数量从107CFU/mL减少到103CFU/mL，没有检测出Sal.enteritidis949575，表明菌株C1/23的混合制剂对两种细菌皆有显著的抑制作用[23]。

2.2.2 空肠弯曲杆菌 空肠弯曲杆菌主要来自于畜禽粪便和宰后胴体中，以产生热敏型肠毒素引起人类结肠炎、腹泻等疾病。Messaoudi等从鸡肠道中分离获得，Lb.salivariusSMXD51对空肠弯曲杆菌进行拮抗作用研究，结果表明菌株SMXD51对4株空肠弯曲杆菌生长都具有较强的抑制作用，进一步发现拮抗物质是乳酸菌形成的细菌素salivaricin SMXD51[24]。Thomas等将不同浓度空肠弯曲杆菌菌液添加到乳酸菌发酵香肠中，当添加浓度为102CFU/g时，12～24h内可以检测到空肠弯曲杆菌；当浓度提高到104CFU/g和106CFU/g时，48h内空肠弯曲杆菌数量不增加。相反，8d后乳酸菌数量从开始的105.49CFU/g上升至109.45CFU/g，说明发酵过程中乳酸菌可抑制空肠弯曲杆菌的生长[25]。

2.2.3 副溶血弧菌 弧菌广泛分布在海水和海洋生物体内，其中副溶血弧菌污染海产品后，可引起人类的食物中毒，O3：K6型副溶血弧菌在我国海域海产品中最为常见[26]。杨红玲等从斜带石斑鱼仔鱼体内分离获得3株乳酸菌EA-1、Y1B-3和Y4-2，分别对致病性哈维氏弧菌和溶藻性弧菌进行抑菌实验研究，结果显示3株乳酸菌对哈维氏弧菌和溶藻弧菌的抑菌直径均在10mm以上，拮抗作用具有热稳定性且不受乳酸的影响[27]。Kongnum等从对虾消化道中分离获得202株乳酸菌，从中筛选出菌株Lb.plantarumMRO3.12，对哈维氏弧菌的抑菌效果较强。进一步将乳酸菌MRO3.12添加到饵料中，喂养南美白对虾，6周后乳酸菌喂养组的存活率是98.89%，而对照组的存活率只有68.89%[28]。乳酸菌能够与副溶血弧菌产生良好的拮抗作用，通过破坏细菌细胞膜的结构抑制其生长。Ma等将副溶血弧菌经乳酸杆菌JK-8和JK-11的无细胞上清液处理0.5～3h后，在扫描电子显微镜下，副溶血弧菌的细胞膜明显破裂，同时表面出现了不规则的褶皱。说明了乳酸菌能够破坏副溶血弧菌的细胞膜结构，从而抑制其生长[29]。

从以上的乳酸菌对革兰氏阴性致病菌的抑制作用来看，乳杆菌和乳球菌对肠道致病菌具有拮抗活性，其作用依靠乳酸菌素。此外，乳杆菌对海洋弧菌的拮抗作用依靠代谢产物，具体物质尚不清楚。

3 乳酸菌拮抗食源性致病菌在食品领域的应用

乳酸菌作为拮抗生物制剂已在乳制品、肉制品、水产品以及一些果蔬制品中广泛应用，主要针对产品中的单增李斯特菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等致病菌。

3.1 乳制品

Settanni等应用乳酸菌混合制剂（3株Lb.paracasei、1株Lb.rhamnosus和2株Streptococcus macedonicus）与多种致病菌一同添加到原料乳中制作奶酪，发酵6d后Lb.paracasei和St.macedonicus的数量分别上升了103.04CFU/g和101.21CFU/g。相反，大肠杆菌O157∶H7和金黄色葡萄球菌分别下降了101.83CFU/g和102.22CFU/g，没有检测出单增李斯特菌，表明乳酸菌制剂对多种致病菌具有较强的控制作用[30]。Bastos等将104.36CFU/mL大肠杆菌O157∶H7与酸奶发酵剂一同添加到原料乳中，发酵30d后，St.thermophilus和Lb.delbrueckii维持在108CFU/mL和109CFU/mL水平之间。第5d时已检测不到大肠杆菌O157∶H7，表明在发酵过程中St.thermophilus和Lb.delbrueckii可有效控制大肠杆菌O157∶H7生长[31]。

3.2 肉制品

Olusegun等将106CFU/gPed.pentosaceusLIV 01和Ped.acidilacticiFLE 01菌悬液添加到经无菌葡萄糖溶液浸泡10min后的新鲜牛肉片上，然后将106CFU/g单增李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌接种到肉表面。在30℃下，单增李斯特菌1d后的数量减少到105CFU/g，第2d数量低于检测极限值（＜102CFU/g）。第2d时，鼠伤寒沙门氏菌数量也减少了102CFU/g，产品的货架期延长到7d[32]。Maragkoudakis等把107CFU/gEnterococcus faeciumPCD71添加到含有105CFU/g单增李斯特菌的鸡肉中，第7d时单增李斯特菌与对照组相比减少了100.7CFU/g。又将107CFU/gLb.fermentumACA-DC179添加到含有105CFU/g肠炎沙门氏菌PT4的鸡肉中，在第2、4、7d后，肠炎沙门氏菌与对照组相比分别减少了100.5、101.3、101.2CFU/g。乳酸菌制剂不仅降低了鸡肉表面的致病菌数量，而且对产品的感官品质没有影响[33]。Senne等将Lb.delbrueckiiRM2-5直接添加在牛排表面进行控制肠道致病菌研究，结果表明大肠杆菌O157∶H7在牛排表面生长缓慢，而对照组生长迅速。同时，将菌株RM2-5的添加在新鲜屠宰的牛和猪胴体表面，在5℃下6d后，大肠杆菌O157∶H7和鼠伤寒沙门氏菌的数量显著性降低[34]。倪萍等从土壤中分离1株具有宽抑菌谱的Lc.lactisNFL，对单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、致病性大肠杆菌和沙门氏菌均有抑制作用，NFL的发酵液在121℃下灭菌20min，对托盘包装冷却猪肉具有明显的保鲜效果[35]。

3.3 水产品

Tahiri等将106CFU/gCarnobacterium divergensM35添加到冷冻鲑鱼中，并后在鲑鱼表面涂抹150μL 103CFU/g单增李斯特菌，10d内单增李斯菌的数量减少了102.6CFU/g。在4℃条件下，冷冻鲑鱼储存期延长至21d[36]。Yin等利用Ped.pentosaceusL和Ped.pentosaceusS添加乳酸菌为发酵剂，以鲭鱼肉浆为发酵原料，37℃培养72h后，pH快速下降且可有效抑制葡萄球菌和肠杆菌的生长，其数量均小于102CFU/mL。鲭鱼肉浆与4%蔗糖混合后充填至肠衣制造发酵鲭鱼香肠，在4℃贮藏3周，其间的乳酸菌、pH均维持不变。但肠杆菌和葡萄球菌则有效地被抑制[37]。

3.4 果蔬产品

Trias等应用从新鲜蔬菜和水果中分离的Leuconostocspp.、Lb.plantarum和Weissella confusa对埃希氏大肠杆菌、单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌抑制作用研究，结果表明乳酸菌可使伤寒沙门氏菌和大肠杆菌的数量降低1～2个数量级，单增李斯特菌则完全被抑制，有效地延长了鲜切果蔬的货架期[38]。Paramithiotis等将102CFU/mL的单增李斯特菌LQC 15091和鼠伤寒沙门氏菌LQC 15111添加到发酵菜花中，第5d到发酵结束，乳酸菌的数量一直维持在107.5CFU/mL和108.5CFU/mL之间。第5d单增李斯特菌数量在105CFU/mL以下，发酵终期时数量下降到104.8CFU/mL。鼠伤寒沙门氏菌在第3d达到105CFU/mL，但7d后数量下降到初始的水平[39]。

通过以上乳酸菌对食品致病菌控制作用研究结果表明：在保持产品品质的同时，乳酸菌对乳制品、肉制品、水产品和果蔬制品的致病菌具有较强的抑制作用，取得了良好的应用效果。

4 结论与展望

乳酸菌是传统发酵食品中的重要微生物类群，在发酵过程中，乳酸菌不仅对产品的品质产生主导作用，而且还具有抑制产品中腐败菌和致病菌生长，保障产品安全和延长保质期的作用。大量研究表明，乳酸菌对食品中革兰氏阳性和阴性致病菌皆具有较强的拮抗作用，并且在乳制品、肉制品、水产品、果蔬制品和发酵面制品中应用取得令人满意的效果，乳酸菌作为一种新型食品生物保护剂具有良好的发展前景。由于乳酸菌种群构成的多样性，乳酸菌拮抗机制的复杂性以及应用和食品品种和环境的千差万别，如何充分挖掘乳酸菌资源，获得高效、广谱、应用面广的乳酸菌生物保护剂是科研工作者研究的目标。

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