质谱技术在感染性疾病诊断中的应用进展

杭亚平综述，胡龙华，王小中审校

(南昌大学第二附属医院检验科，江西 南昌330006)

质谱 (mass spectrometry，MS)作为一种分析手段已出现几十年，1975年质谱技术就已初步用于细菌的快速鉴定，但直到l988年基质辅助激光解吸电离(MALDI)、电喷雾电离(ESI)等软电离技术的出现才得到进一步快速发展。MALDI分析时激光以脉冲方式使分子电离，恰好与TOF检测器相匹配，组成了MALDI-TOF MS，很适合微生物多种生物大分子的分析[1]。最近，在MALDI-TOF MS基础上引入了全细胞质谱(WC-MS)[2]，进一步缩短了细菌鉴定时间(最快仅1h)，使直接对来源于血液和尿液标本的病原菌进行分析和鉴定成为可能，这是目前其它细菌鉴定方法所无法比拟的。

MALDI-TOF MS的基本原理是将样品与过量的小分子基质的混合溶液点加在样品的靶盘上,用激光照射样品与基质形成的共晶体,基质分子吸收能量与样品解吸附并使其电离，样品离子在TOF电场作用下加速飞过飞行管道，通过检测飞行时间确定离子的唯一质荷比,串联质谱，形成不同高度波谱峰的质谱图。MALDI-TOF MS技术通过微生物蛋白质表达谱中的特征谱峰来区分细菌的属、种、株，甚至不同亚型。最后用标准菌株或来源分型明确的菌株建立的细菌质谱图库或相关软件将检测结果与细菌库进行比较。模式匹配得出分数，分值大于2.0鉴定到种；1.7～2.0之间鉴定到属；小于1.7鉴定结果不可信，从而得到结果[1]。

1 MALDI-TOF MS的常规应用

快速分离鉴定病原微生物，是临床抗感染治疗成功的关键。目前，大多数临床实验室仍然采用传统的细菌鉴定手段，如标本接种、分离培养、革兰染色、生化反应、血清学试验，这些方法不但费时，且鉴定细菌能力有限，尤其对一些难生长或生长慢的细菌常常不能鉴定，即使自动化鉴定仪也常会出现无法鉴定的细菌。MALDI-TOF MS与传统的检测方法比较优势显著，可实现对未知微生物的快速鉴定、分型、溯源以及毒力分析等，具有操作简便、测定速度快、灵敏度高、特异性强、信息直观、易于自动化、检测范围广以及样品的纯度要求不高等优点，将微生物的鉴定时间由以小时计算推进到分钟计算，逐渐被临床实验室所采纳，MALDI-TOF MS的出现或许将有可能取代一直以来传统的微生物鉴定流程的主导地位，改变现有的临床微生物鉴定模式。

1.1 MALDI-TOF MS对常见细菌的鉴定 对临床大多数的标本如鼻咽分泌物、咽拭子、尿液及血液等进行微生物过夜分离培养，将其菌落进行MALDI-TOF MS，一个样本的分析时间只需几秒钟，并高通量检测，整个鉴定周转时间显著缩短。MALDI-TOF MS能准确鉴定一大类常见细菌，包括革兰阳性菌和阴性菌，如葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属、肠杆菌科细菌、非发酵革兰阴性杆菌等。

Bright[3]等人利用212种细菌建立一个较为完善的细菌质谱图搜索引擎与应用软件MUSETM(the Manchester metropolitan university search engine)，在株种属水平上的准确率分别为79%、84%和89%。近年来，张明新等[4]复苏560株临床分离株，应用MALDI-TOF MS与Vitek2鉴定结果比较，G+细菌鉴定符合率为94.6%；G-细菌鉴定符合率为96.7%；酵母菌鉴定符合率为95.0%，15株鉴定结果不符的菌株经16S rDNA测序确认，结果与MALDI-TOF MS鉴定符合率更高。

不动杆菌属已经成为院内感染的常见病原菌，且鲍曼不动杆菌耐药及多重耐药性严重，不同种之间不动杆菌感染治疗措施有所不同，目前临床上通过表型、生化反应鉴定得到的结果实际上是鲍曼不动杆菌群。Kishii K等[5]应用MALDITOF MS对123株临床分离的不动杆菌属进一步鉴定，能够确认到种的有106株(86.2%),其准确率达84.0%，而16株(13.3%)只能鉴定到属，该研究还显示皮氏不动杆菌的感染率超过了鲍曼不动杆菌达到34.1%。MALDI-TOF MS对于常规方法无法准确区分的复合菌的鉴定是很有意义的，临床上很多复合菌如不动杆菌、阴沟肠杆菌等，分类广泛、亚群复杂，MALDI-TOF MS能把复合菌内很多微生物鉴定到物种水平。

1.2 MALDI-TOF MS对难培养微生物 (苛养菌、微需氧菌、厌氧菌等)的鉴定 难培养微生物的鉴定一直是临床微生物工作者面临最棘手的问题。由于其生长慢、生化反应不活跃，自动化鉴定仪及API鉴定条都很难鉴定。MALDI-TOF MS弥补了微需氧菌及厌氧菌等难鉴定、培养要求苛刻的病原体的生化鉴定方面的不足。近年来我们已利用MALDI-TOF MS实现了对流感嗜血杆菌[6]、幽门螺杆菌[7]及厌氧菌[8]等微生物的鉴定，大大降低了这类难培养微生物鉴定的漏检率并缩短所需时间，最大限度地满足了临床的需求。

1.3 MALDI-TOF MS对真菌的鉴定 真菌的分类鉴定一直是国内外研究热点，常规形态学方法虽然直观、简便，但样品前处理繁琐、培养周期长、时效性差，无法满足临床快速准确诊断的要求。MALDI-TOF MS可用来鉴定酵母菌、酵母样菌、丝状型真菌，Marklein等[9]利用MALDI-TOF MS对250株临床分离的念珠菌进行鉴定，96%可准确鉴定，van Veen S等[2]的鉴定结果也表明对酵母样真菌的鉴定准确率达85%。目前在丝状真菌鉴定方面的报道较少，主要原因是丝状真菌可表现出完全不同的表型影响蛋白图谱形成、蛋白提取无标准程序及目前数据库中参考图谱有限。最近MALDI-TOF MS在丝状真菌鉴定方面的应用也有进展，譬如曲霉菌和青霉菌[10]，常规鉴定丝状真菌还需进一步完善数据库和建立分析前标准程序。

1.4 MALDI-TOF MS对结核及非典型分枝杆菌的检测 结核及非典型分枝杆菌的营养要求高、生长缓慢、只能通过传统的抗酸染色、罗氏培养基培养、PCR方法进行鉴定，费时、成本高、操作要求高及传染性强。MALDI-TOF MS可以通过快速和准确地获取其特异的蛋白质或全菌质谱图[11]，通过与数据库的比对快速准确得出结果，从而为分枝杆菌的种属鉴定提供了一种快速、简便的方法。

1.5 MALDI-TOF MS对病毒的检测 虽然MALDI-TOF MS在病毒鉴定方面的应用还不普遍，但MALDI-TOF MS被证实是加快病毒鉴定的一种方法。目前，大多数的研究集中在通过MALDI-TOF MS分析病毒特征，分析一些有意义的蛋白，例如衣壳蛋白[12]或病毒融合蛋白[13]。不同的病毒变异体的融合蛋白影响病毒的毒力，进而影响与宿主细胞的结合。

1.6 MALDI-TOF MS对细菌毒力因子的鉴定 在细菌毒力研究方面，MALDI-TOF MS对杀白细胞素(Panton-Valentine leukocidin，PVL)阳性的金黄色葡萄球菌检测[14]的灵敏度为100%，特异性为90.6%，能在4448Da质荷比质谱峰处检测到特异峰，该方法可快速完成金黄色葡萄球菌PVL的毒力鉴定。MALDI-TOF MS在真菌毒力方面也有很好的应用，黄曲霉产毒株和非产毒株的质谱图存在显著的差别，根据质谱峰的不同，产毒黄曲霉菌株和非产毒黄曲霉菌株得以鉴别[15]。

2 质谱的临床应用举例

2.1 质谱对菌血症的诊断 近年来，菌血症的发病率和致死率相当高，快速准确的血流感染病原菌鉴定对于临床抗菌药物的合理使用和病愈率的提高显得至关重要。2010年首次报道了MALDITOF MS直接对阳性血培养瓶进行鉴定的应用，使得直接对血液标本的病原菌鉴定有了可能。随后Stevenson[16]进行了类似的工作，尝试缩短培养时间(4～6h)或不经过分离培养直接从标本中应用MALDI-TOF MS鉴定细菌。在212例血培养阳性标本中鉴定出170株(80.2%)，鉴定准确率为95.3%，而且这种鉴定程序已经被研发成了商业化的Bruke SepsiTyper Kit软件包，取得了显著的进展。血培养阳性标本直接用于细菌鉴定的研究比较普遍[17]，但是仍需要长时间仪器报警及常规分析时间。与传统的血培养金标准需要1～3d的增菌时间和1～2d的鉴定时间的检测技术相比，MALDI-TOF MS可以在2～3h内对阳性血培养瓶中致病菌进行检测和鉴定，缩短了细菌分离培养时间，加快了病床周转率，为临床合理应用抗生素治疗提供了可靠的依据，减少了患者治疗费用。MALDI-TOF MS直接微生物鉴定对于不同种类的培养瓶鉴定准确度均较好，而且对于单一细菌阳性培养瓶的鉴定能力较强，但是对于葡萄球菌的鉴定率较低,可能无法或会忽略对混合菌的鉴定[18]。

2.2 质谱对尿路感染(UTIs)的诊断 UTIs是人类常见感染性疾病，传统的尿路感染诊断主要依赖于尿液分析、尿沉渣涂片革兰染色镜检和细菌培养，但临床更注重的是快速准确的检测技术，现如今利用MALDI-TOF MS的技术优势可以弥补常规方法的不足。有研究[19]对UTIs的220份尿液标本进行常见细菌MALDI-TOF MS直接鉴定，当细菌数量大于105CFU/ml,鉴定到属的一致率92.7%，鉴定到种的一致率为91.8%，尤其对于大肠埃希菌，准确率达97.6%。检测时间缩短到小于30min，提示MALDI-TOF MS能快速、准确地鉴定尿液标本中的病原菌。虽然应用MALDI-TOF MS对多微生物标本直接鉴定只可以告知存在微生物及其丰度，刚好符合绝大多数UTIs患者临床诊断治疗中所关注的重点，所以从各种情况来看，MALDI-TOF MS对尿液标本直接检测几乎是UTIs的配套诊断检测方法。

2.3 质谱在细菌耐药监测中的应用 MALDI-TOF MS可通过检测细菌针对不同抗菌药物各种获得性酶而明确其耐药性。革兰阴性杆菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的最主要原因是产ESBLs酶和碳青霉烯酶。MALDI-TOF MS依据β-内酰胺酶的水解作用、监测β-内酰胺类抗生素分子量的变化可以分析细菌的耐药性，国内外对碳青霉烯酶的研究热点集中在携带 KPC、VIM、IMP、NDM 及 OXA革兰阴性菌株上[20，21]。外膜蛋白与AmpC酶联合是导致细菌对碳青霉烯类抗生素的耐药重要原因，国内研究[22]将MALDI-TOF MS应用于外膜蛋白OmpK36缺失的检测，相较于传统的SDS-PAGE技术优势明显。革兰阴性杆菌亲缘性较强、抗原结构复杂，MALDI-TOF MS对其耐药性检测效果较差，但此方法对葡萄球菌检测结果较好，尤其是耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)，主要通过检测MRSA(PBP2a)蛋白表达的差异来实现耐药性的分析[23]。

MALDI-TOF MS对真菌药敏试验的检测也有了长足的发展。基本原理是菌株在不同药物浓度压力下蛋白组表达差异，最后通过MALDI-TOF MS检测蛋白谱的变化。在此基础上监测白色念珠菌蛋白质的改变，显示了MALDI-TOF MS测定药物敏感试验的可行性[24]。另外，MALDI-TOF MS结合PCR方法可以检测到核苷酸突变，Ikryannikova[25]研究组在此方面贡献突出，检测到结核分枝杆菌blaTEM基因的突变。但总体来说，目前MALDITOF MS对细菌耐药机制的检测还比较困难。

3 质谱目前仍存在的缺陷和展望

总之，MALDI-TOF MS技术可以快速、特异地鉴定常见细菌，以及很好地鉴定真菌、分枝杆菌、苛养菌及厌氧菌，利用其强大的优势改变了临床微生物实验室感染性疾病诊断的传统格局。然而，技术的不够完善及临床需求的不断提高，MALDITOF MS也有局限性。

MALDI-TOF MS难定量、最初的仪器成本高、对抗生素耐药性和耐药机制的检测能力有限，无法鉴定混合菌，而且对于报告的结果缺乏统一的验证和解释。还有MALDI-TOF MS对不常见病原体缺乏相应的数据库，这就要求我们必须加快完善罕见菌数据库的速度来满足临床的要求。在日常工作中，MALDI-TOF MS灵敏度还不高，对一些进化过程中比较接近、蛋白表达相似的细菌的辨别有较大困难。比如，无法区分志贺菌和(或)O157大肠埃希菌与普通的大肠埃希菌，以及不能鉴别肺炎链球菌和轻型链球菌/口腔链球菌。另外微生物在不同环境条件下蛋白表达不同，所以MALDITOF MS要常规应用于临床必须要进行前处理程序的标化和评价，保证技术的重复性，将会扩展MALDI-TOF MS在感染性疾病诊断的实际应用。

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