海南省消除疟疾后期间日疟原虫裂殖子表面蛋白1基因(MSP-1)多态性检测

李雨春，王善青，胡锡敏，王光泽，蒙 锋，曾 文，陈春香，童重锦

间日疟原虫裂殖子表面蛋白1(PvMSP-1)是广泛表达于间日疟疟原虫裂殖子表面并参与免疫反应的优势抗原，也是检测疟原虫较为有价值的多态性标记物之一[1]。该基因由10个保守区和可变区组成的，其中由两侧保守区域5(ICB-5)和6(ICB-6)组成第5区域(Block5)的显示多态性特点，依据该区域的氨基酸组成类型分为Belem 类型(Ploy-Q)、Salvador-1型以及二者重组性[2]。这些基因类型对间日疟进行有效的分子流行病学监测和分子生物学研究[3]。海南省曾是我国疟疾高发区域，主要以恶性疟和间日疟为主，近年来海南疟疾疫情大幅下降，本地疟疾发病率逐年降低，但间日疟发病数占报告病例比例呈现逐年上升趋势。海南于2010年7月正式开展消除疟疾工作，在海南省消除疟疾前期，我们自2009年收集了对海南本地流行的间日疟原虫株，并对这些虫株的MSP-1基因进行序列分析，以便对消除疟疾后期有效对输入性疟疾和本地疟疾进行更好的分子水平的监测。

1 材料与方法

1.1调查区概况和样本采集 收集全省2009-2012年网报间日疟病例共36份，有效扩增并完成测序共30份，其中本地病例27份，输入性病例3份，分布于海南省疟疾流行6个市县。

1.2DNA 提取及MSP-1PCR扩增 采用Qiagen Mini Blood DNA 提取试剂盒对血样进行DNA提取，80 μL全血，180 μL ATL缓冲液，20 μL蛋白酶K，56 ℃孵育1 h, 随后按照试剂盒说明进行DNA提取，最后加入80 μL TE缓冲液-20 ℃保存。采用特异性引物MSP-1A(5′-GAGCCCTACTACTTGATGGTCC-3′) 和 MSP-1B (5′-CCTTCTGGTACAGCTCAATG-3′)对间日疟MSP1基因进行扩增[4]，20 μL扩增体系如下：DNA模板5 μL，1× reaction buffer，2.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L of each dNTP, 10 pmol引物和1 UpfuDNA polymerase(Tiangen, Beijing). 反应条件：95 ℃变性5 min, 35 个循环95 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 90 s; 72 ℃延伸5 min, PCR 反应产物1.5%琼脂糖电泳检测。

1.3序列分析及进化树构建 ExPASy Molecular Biology (http://us.expasy.org/) 用来将核酸序列翻译成蛋白序列， WBioEdit version 7.0软件(www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/BioEdit.html), CLUSTAL X and EditSeq 3.88(DNASTAR, Madison,WI)用来序列比对和分析. MEGA 3.1 用来进行遗传进化树构建和遗传进化分析。

2 结果

2.1样本分布情况 从全省网报疟疾样本分布情况来看，网报间日疟病例主要集中在海南中南部地区，东部北部地区相对较少，见表1。

2.2PvMSP-1 基因分析 从27个间日疟样本分析来看，Sal-1型有24个，占全部样本数的88.8%，9个Sal-1亚型，属于优势型。Belem 型有2个，同属于1个Belem型，占样本数的7.4%，重组型的有1个，占全部样本数的3.7%,表2。

表1 2009-2012年收集间日疟病例分布情况

表2不同亚型的间日疟裂殖子表面蛋白(MSP-1)数量及氨基酸替换序列

Tab.2Numbersofdifferentsubtypesofmerozoitesurfaceprotein-1ofPlasmodiumvivaxandsequencingofaminoacidwithsubstitutes

TypeNosCharacteristic sequencing of amino acidSal typeVIAAENTNSal-a7QATAAEDKKEYEKTNQNMYNSal-b1QATAAEDKKEYEKTNQNIDNSal-c3HVTAVQKNNSal-d1ATAVQKNSSal-f2PVTAVQNTNSal-g3VTAVQKNSSal-h1HVTAVQKNNSal-i5ATAVQKNSSal-j1QVTTVQKNSBelem typeBelem-12KKELLDQYKLNADEQNKINET(20 Ploy Q)Recombinant typeRecombinant type-11NTVADIAKSATGTGNVQAVTKEDQKQNKEN (19 PloyQ)

以Sal-1标准株(AAN86207)为参考序列，我们发现在不同亚型间主要发生8处氨基酸序列的替换，(V/A, I/T, A/T, A/V,E/Q,N/K,T/N,N/S)和1处由组氨酸或脯氨酸或谷氨酰胺氨基酸的插入。在a亚型和b亚型种还发现有DKKLLKEYELNADEKTKINQN连续的氨基酸替换，其中b亚型在连续替换的基础上还有M/I, Y/D的2次连续替换。Belem型只有1个亚型，与参考序列相比(AAN86208)该亚型有一个连续氨基酸替换序列KKELLDQYKLNADEQNKINET，并含有20个多聚谷氨酰胺序列。重组型的各含有Sal型和Belem型的部分序列，有19个多聚谷氨酰胺序列,图1。

图1 不同亚型间日疟裂殖子表面蛋白氨基酸序列比对结果

2.3PvMSP-1 进化树分析 通过进化树分析可以看出，间日疟Sal-1型与Belem型及重组型可以较好的区分开，属于不同进化簇。经进一步比较发现，Belem亚型(Hainan B-1)的虫株与Belem 参考序列(AAN86208)和土耳其虫株(CAD38667)的同源相似性均为94%，且与土耳其虫株同源相似性高；在Sal株系中，Hainan a亚型和b亚型与参考序列(AAN86207)的同源相似性分别达到95%和94%，而Hainan c-i亚型与参考序列的同源相似性均为97%。另外，还发现Hainan a亚型和b亚型独立成一簇，而其他Sal亚型与其他国家的株系亲缘关系较近，同属一个大簇，如Hainan S-c，Hainan S-e，Hainan S-f，Hainan S-g，Hainan S-i与巴西株(AAN86239)相近,同源相似性达到99%，Hainan S-d，Hainan S-h与伊朗株(AAM53559)相近，同源相似性达到100%。而重组型的海南株虽属于同一重组型的大类，但海南株与其他重组株还有较远的亲缘关系，与福建株(AAS46772)和朝鲜株(AAG53740)相似性分别是98%和90%，见图2。

3 讨 论

海南省位于我国北纬25°以南地区，是我国高度疟疾流行区域，主要流行恶性疟和间日疟。近年来，在我国政府和全球基金的支持下，我省疟疾疫情得到有效遏制，流行程度大幅减低，流行范围明显缩小，2010年正式实施消除疟疾策略。自2010年后，未有本地感染的恶性疟报告病例，以间日疟流行为主[5]。

间日疟在海南省均有分布，但近年来随着消除疟疾工作推进，我省间日疟主要分布在海南南部地区，中北部地区病例较少。从表1中样本分布可以看出，南部地区如保亭三亚报告病例占所有病例的50%以上。海南省间日疟的消除过程可能是从北部地区开始，到中部，最后是集中南部区域。对这些间日疟本地病例间日疟裂殖子蛋白1基因分析得知，裂殖子表面蛋白1基因(MSP-1)具有较强的多态性，27份样本中竟然有11个不同亚型的虫株，并且形成Salvador-1型仍是优势基因型，其次Belem 类型(Ploy-Q)，而重组性较少，这一结果与张山鹰[6-8]，江钢锋[9]报告一致。说明海南省消除疟疾阶段，间日疟流行株系的MSP1仍以Salvador-1为主。另外，本次调查还发现2种新型基因亚型的虫株(Sal-a和Sal-b)，该基因型不仅发生单个氨基酸之间的替换，更重要的该基因型是有连续的与Belem型相似的氨基酸替换。这一发现在国内尚未见类似的报道，但韩国的Sung-Ung Moon、缅甸曼德勒同样也发现类似的氨基酸替换Salvador-1型[10]。Sal-c和Sal-i未发现连续的氨基酸替换，仅有个别氨基酸的零星点替换。从构建的进化树结果也支持上述结论，本次实验发现的Salvador-1型中各亚型主要被划分为3个大类，其中Sal-a和Sal-b与其他亚型差距较大，独成一类，而其余亚型相对聚集性一类。Belem型本次调查中虽有2例但同属于同一亚型，为常见20个谷氨酰胺的重复，从进化树得知，该型与其他亚型同属于常见Belem型。重组型仅有一个亚型，属于为II/Q/S型重组型，但该重组型在基因库中未发现同源序列，可能属于新型的重组亚型，有待于进一步研究。本次调查中，尚未发现不同等位基因型的混合感染型和朝鲜型的虫株，可能与疟疾疫情得到有效控制，传播减少有关。

图2海南不同亚型间日疟氨基酸序列进化树

Fig.2PhylogenetictreeconstructedbyaminoacidindifferentsubtypesfromHainanIsland

参考文献：

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江钢锋, 李娟兰, 吴少廷, 等. 我国华南间日疟原虫裂殖子表面蛋白1等位基因分型和序列分析[J]. 中国人兽共患病杂志, 2002, 18 ( 2): 57-60.

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