益精方对小鼠精子线粒体功能的影响

李 柱罗少波张金颖贾金铭胡海翔

1. 空军总医院康复医学科（北京 100142）;

2. 中国中医科学院广安门医院南区男科; 3. 中国中医科学院广安门医院男科

益精方对小鼠精子线粒体功能的影响

李 柱1罗少波2张金颖2贾金铭3*胡海翔1

1. 空军总医院康复医学科（北京 100142）;

2. 中国中医科学院广安门医院南区男科; 3. 中国中医科学院广安门医院男科

目的观察益精方对环磷酰胺所致少弱精子症模型小鼠精子线粒体功能的影响。方法将 40只雄性昆明小鼠随机分为对照组（CG）、模型组（MG）、小剂量中药治疗组（SG）和大剂量中药治疗组（LG）。按60mg/kg体质量给CG小鼠腹腔注射生理盐水（NS），给MG、SG、LG小鼠腹腔注射环磷酰胺，每天1次，连续5d，第6天开始按体质量分别给SG和LG小鼠灌服益精方，剂量分别为人类常规用量（以60 kg为标准）的1倍和5倍，MG小鼠给予等体积的NS灌胃，每天1次， 连续34 d，CG常规饲养，然后对小鼠进行精液常规分析，流式细胞术检测精子线粒体功能。结果CG、MG、SG和LG 组小鼠附睾精子密度分别为（5.20±1.34）、（1.73±0.03）、（2.08±0.01）、（3.31±0.56）×106/mL；精子活力[（a+b）级精子百分率]分别为（14.49±0.30）%、（6.64± 1.88）%、（11.99±1.01）%、（19.40±3.13）%；精子活率[（a+b+c）级精子百分率]分别为（68.39±15.13）%、（39.96±4.89）%、（62.28±4.43）%、（73.61±5.05）%。MG组精子密度、精子活力、精子活率显著低于CG组（P＜0.05）；经治疗后LG组精子密度、精子活力和精子活率明显增加，与MG组比较有显著性差异（P＜0.05），而与CG组在精子活力和精子活率上没有明显区别。在CG、MG、SG和LG组，线粒体功能良好精子的百分率分别为（1105.93±0.33）%、（848.55±6.15）%、（888.77±22.46）%、（1000.885±72）%，线粒体功能丧失精子的百分率分别为（27.94±0.32）%、（42.43±1.00）%、（35.11±1.23）%、（30.91±0.44）%，MG小鼠精子线粒体功能良好的表达量明显下降，而线粒体功能丧失的表达量明显增多，与CG小鼠比较均有明显差异（P＜0.05）； 经治疗后，LG小鼠精子线粒体功能良好的表达量显著性增加（P＜0.05），同时线粒体功能丧失的表达量明显减少，与MG小鼠比较有明显差异（P＜0.05）。结论腹腔注射环磷酰胺可使小鼠精子密度、精子活力、精子活率降低，大剂量益精方可以增加小鼠精子密度，并增加精子线粒体功能，提高精子活力和精子活率，从而达到治疗少弱精子症的目的。

益精方; 线粒体; 弱精子症; 小鼠

我国育龄夫妇患不育症的发病率在10%左右，并有增加的趋势，其中因男性生育能力缺欠所致的不育症约占50%[1]。以“益精方”为代表的中医药治疗男性不育症之少弱精子症疗效明显[2,3]，但其治疗机制一直不甚明了，本研究试图从精子线粒体功能的角度对其治疗弱精子症的机制进行解读。

材料与方法

一、实验动物及分组

清洁级雄性昆明小白鼠40只（购于中国医学科学院实验动物研究所），体重18～20 g，采用数字法随机分为对照组（control group, CG）、模型组（model group, MG）、小剂量中药治疗组（small dose group, SG）、大剂量中药治疗组（large dose group, LG），每组10只。

二、主要器材

流式细胞仪：美国B D公司产品，型号：FACSCalibur; Allagra.21R Centrifcige高速冷冻离心机（德国BACKMAN公司）；DU640型紫外线分光光度计（德国BACKMAN公司）；WL-9000型伟力精子分析仪（北京伟力新世纪科技发展有限公司）；DRHW-1型恒温水浴箱（北京市医疗设备总厂）等。

三、主要试剂

罗丹明123（Rhodamine 123,Rh123）和碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）：均为Sigma公司产品，Rh123，Cat：R8004，用蒸馏水配制为1 g/L储存液，0～4℃避光保存备用；PI，Cat：P4170。

BWW低蛋白培养液、BWW高蛋白获能液：NaCl 554 mg/100 mL，KCl 35.6 mg/100 mL，KH2PO416.2 mg/100 mL，NaHCO3210 mg/100 mL，葡萄糖100 mg/100 mL，丙酮酸钠 3 mg/100 mL，乳酸钠 370 μl/100 mL，庆大霉素 125 μl/100 mL，0.5%酚红 50 μl/100 mL。精子处理用含0.3%人血清白蛋白的BWW低蛋白液，精子获能用含3.5%人血清白蛋白的BWW高蛋白获能液。

孵育缓冲液：10 mmol/ L HEPES、140 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L CaCl2，pH =7.4。

PBS液：8g/L NaCl、0.2 g/L KCl、1.44 g/L Na2HPO4•7H2O、 0.24 g/L KH2PO4•H2O、 pH =7.2。

四、实验用药

“益精方”主要成分：当归、红花、五味子、菟丝子、桑葚、桑螵蛸、炒苍术、仙灵脾、肉苁蓉、韭菜子、黄精、玉竹、熟地等，每付药材中含生药199g，按常规方法煎熬并浓缩成含生药1g/mL的药液，冷藏于4℃冰箱备用。

五、方法

实验小鼠适应性驯养5 d后，根据文献报告[4]及预实验的结果，CG按体质量60 mg/kg腹腔注射生理盐水（NS），MG、SG、LG按体质量60 mg/kg腹腔注射环磷酰胺，每天1次，连续5 d。从第6天开始给予治疗药物（记为d1，以后按时间顺序依次记录为d2、d3……）以人体60 kg为标准，按体质量分别给SG和LG小鼠灌服“益精方”，剂量分别为人类常规用量（每天每公斤体质量消耗生药量约为3.3 g）的1倍和5倍并用NS将药液体积调配成相同大小，MG小鼠给予等体积的NS灌胃，每天1次，共灌胃34 d。灌胃期间，每周给小鼠称量1次，并根据新的体重调整灌胃药量。灌胃结束后的第二天将实验小鼠处死后迅速摘取睾丸、附睾、输精管，迅速剥除粘连的血管、韧带及脂肪等组织，备用。

（一）小鼠精子的采集

双侧附睾置于洁净培养皿中，用眼科剪沿附睾纵轴剪一刀使其分为大致均匀的两半，然后沿横轴剪两刀使附睾分为大致均匀的6段，将剪碎的附睾组织移入预置常温孵育缓冲液1 mL的试管中，然后用1 mL孵育缓冲液冲洗培养皿，冲洗液移入装附睾的试管中。

摘取睾丸和附睾后，分离输精管，于输精管与附睾尾结合部、输精管与前列腺结合部剪切离断输精管。用胰岛素注射针抽取孵育缓冲液1 mL，沿输精管一侧断端将针头插入输精管管腔内，轻推注射器，可见另一侧断端流出1～2滴乳白或灰白色液体，内含大量精子，将所得液体滴入装附睾的试管中，并用注射器中剩余孵育缓冲液冲洗输精管管腔，并将液体全部滴入装附睾的试管中。将所得精子置于37℃恒温孵育箱中孵育30 min备用。

（二） 精子常规分析

精子于37℃恒温孵育箱中孵育30 min后，小心吸取上层液体，360×g，离心5 min，沉淀物加入1 mL BWW高蛋白获能液，置于37℃恒温孵育箱中获能2 h，参照人类精子分析方法用伟力精子分析仪对精子密度、精子活力等进行常规分析。

六、精子线粒体功能测定

精子于37℃恒温孵育箱中孵育30min后，小心吸取上层液体，360×g，离心5min，沉淀物加入PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）洗涤2次后离心360×g，离心5min。PBS悬浮沉淀精子，调精子密度为1×106/m，加入Rh123（终浓度10μg/mL），置于37℃水浴孵育10 min，离心弃上清， PBS重复洗涤离心2次， PBS悬浮，加入PI（终浓度10μg/mL）染色5 min，上流式细胞仪检测。

七、统计学分析

使用SPSS11.5软件对正态分布数据进行ONEWAY ANOVA检验，数据用±s表示。P＜0.05为有显著性差异。

结 果

一、小鼠附睾精子常规检查结果

结果表明，与C G比较，M G精子密度、精子活力[（a+b）级精子百分率]、精子活率[（a+b+c）级精子百分率]显著下降（P＜0.05）；与MG比较，LG精子密度、精子活力、精子活率有明显升高（P＜0.05），见表1。

表1 小鼠精子密度、活力及活率比较（±s, n=10）

表1 小鼠精子密度、活力及活率比较（±s, n=10）

注: 与CG比较, :P＜0.05; 与MG比较, #:P＜0.05; 与SG比较, :P＜0.05

度(×106/mL) (a+b)级精子(%)组别 精子密(a+b+c)级精子(%) CG 5.20±1.34 14.49±0.30 68.39±15.13 MG 1.73±0.03*6.64±1.88*39.96±4.89*SG 2.08±0.01*11.99±1.01 62.28±4.43#LG 3.31±0.56*#19.40±3.13#▲73.61±5.05#*▲

二、线粒体功能测定结果

结果表明，与CG比较，MG小鼠精子线粒体Rh123表达明显下降，而PI表达明显增多（P＜0.05）；与MG比较，LG小鼠精子线粒体RH123表达显著性增加，同时PI表达明显减少（P＜0.05），见表2，图1。

表2 线粒体功能测定结果比较（±s , n=10）

表2 线粒体功能测定结果比较（±s , n=10）

注: 与CG比较,*:P＜0.05; 与MG比较, #:P＜0.05; 与SG比较,▲:P＜0.05; Rh123%: 线粒体功能良好的精子百分数; PI%: 线粒体功能丧失的精子百分数

Rh123% PI% CG 1105.93±0.33 27.94±0.32 MG 848.55±6.15*42.43±1.00*SG 888.77±22.46*35.11±1.23*# LG 1000.885±72*#▲30.91±0.44*#▲

讨 论

精子运动依赖线粒体提供能量，当精子线粒体功能异常，其能量合成减少，导致了精子活动力减弱。线粒体功能是通过氧化磷酸化合成ATP，为精子运动提供能量，而ATP合成过程与线粒体内电子传递有关。因此精子线粒体结构是否完好以及线粒体DNA是否受损，将影响到线粒体内ATP能量合成，进而影响精子活力、活率甚至精子的存活。

图1 线粒体功能散点图

环磷酰胺为目前广泛应用的烷化剂类抗肿瘤药物，其进入体内被肝脏或肿瘤内过量的磷酰胺酶或磷酸酶水解，变为有活性的磷酰胺氮芥，与DNA 发生交叉联结，抑制DNA的合成，也可干扰RNA的功能，可对人体多系统产生毒副作用[5]。环磷酰胺腹腔注射后，模型组小鼠出现精子活力和活率明显下降，出现明显的弱精子症表现，这一作用可能与精子线粒体功能损伤有关。

本实验表明，造模后小鼠线粒体功能良好的精子百分数（Rh123%）明显下降，而线粒体功能丧失的精子百分数（PI%）明显增多，与空白组小鼠比较均有明显差异（P＜0.05）；经“益精方”治疗后，线粒体功能逐渐好转，大剂量组小鼠线粒体功能良好的精子显著性增加（P＜0.05），同时治疗后线粒体功能丧失的精子明显减少，与模型组小鼠比较有明显差异（P＜0.05）。

“益精方”是贾金铭主任治疗少、弱精子症的系列方剂之一，在临床治疗中疗效可靠[2,3]。根据中医理论，当归为补血活血之圣药，功用补血活血，调经止痛；菟丝子为传统男性不育古方“五子衍宗丸”之主药，入肾填精；红花与当归合用，瘀去而新生，精血充沛而不滞；桑葚固精缩尿，补肾助阳，益精生子；桑螵蛸滋阴补血，生精润燥；熟地补血滋阴、益精填髓，共同辅佐菟丝子达到补肾填精的效果。仙灵脾补肾壮阳，益命门之火；肉苁蓉补肾阳、益精血、暖腰膝；韭菜子补肝肾，暖腰膝，三药合用，温养肾阳，使精子活动能力增加。黄精、玉竹益气滋阴，五味子收敛固涩，益气生津，苍术燥湿健脾。全方以当归、菟丝子为君，以红花为臣辅助当归养血活血化瘀，以熟地、桑葚、桑螵蛸为臣辅助菟丝子以补肾填精，同时以仙灵脾、肉苁蓉、韭菜子为臣温肾助阳以壮肾气，佐以五味子收敛、苍术燥湿健脾，共凑活血养血、补肾生精之功。

现代研究表明，方中药物能从不同靶点角度改善睾丸、附睾和精子的功能。当归[6]能改善外周循环，能促进细胞再生和恢复，对非特异性和特异性免疫功能均有增强作用；与红花同用，达到改善睾丸局部微循环，促进活性氧自由基（reactive oxygen species, ROS）清除，增加精子生成的目的。菟丝子水煎剂能明显增强黑腹果蝇交配次数，菟丝子水提物对ROS所致人精子膜损伤有保护作用[7]；仙灵脾[8,9]能改善下丘脑-垂体-性腺轴的功能；肉苁蓉[10-12]能抗氧化抗衰老；韭菜子[13-15]中铁、锌、镁、钙含量丰富，能抗氧化，增加睾丸、附睾、精囊腺的质量；熟地[16,17]能提高单核细胞的活性，提高机体抗疲劳、抗衰老及清除自由基的能力；桑葚[18,19]富含镁、铁、锌等微量物质，能降低血清总胆固醇、甘油三酯水平，促进血液循环；桑螵蛸[20,21]富含人体必需的8种氨基酸、磷脂，能增强机体抗疲劳能力，提高睾丸指数。诸药合用，从多系统、多靶点对男性生殖功能产生作用，促进精子生成、改善精子活力，其作用的具体过程尚需进一步研究。

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（2014-06-26收稿）

Effects of Yijingfang on mitochondrion in the mouse model of cyclophosphamide-induced oligoasthenospermia

Li Zhu1, Luo Shaobo2, Zhang Jinying2, Jia Jinming3*, Hu Haixiang1
1. Deptment of Rehabilitation Medicine，General Hospital of Air Force PLA, Beijing 100142, China;
2. Department of Andrology, Guang'anmen Hospital South Area; 3. Department of Andrology, Guang'anmen Hospital

Jia Jinming, E-mail: nanke1145@126. com

ObjectiveTo observe the effects ofYijingfangon the mitochondrion in the mouse model of cyclophosphamide-induced oligoasthenospermia.MethodsForty Kunming male mice were randomly divided into four groups such as the control group (CG), the model group (MG), small-doseYijingfanggroup (SG), and large-doseYijingfanggroup of (LG). The mice of CG were intraperitoneally injected with normal saline at 60 mg/kg once a day ,while those of MG, SG and LG with cyclophosphamide, all for 5 days. During the next 34 days, the mice of SG and LG received intragastric administration ofYijingfangonce a day, the former at a dose 2times and the latter 5 times that of human routineusage, those of MG given the same volume of normal saline, and CG normally fed. At 35 days, we measured the sperm count, percentages of grades a+b and a+b+c sperm, and the function of mitochondrion in the epididymal sperm of the mice.ResultsThe sperm counts of CG, MG, SG and LG were(5.20±1.34), (1.73±0.03), (2.08±0.01) and (3.31±0.56)×106/mL, respectively, and sperm number was signif cantly lower in MG than that in CG (P<0.05), but higher in LG than that in MG (P<0.05). The grade a+b sperm constituted (14.49±0.30), (6.64±1.88), (11.99±1.01) and (19.40±3.13)% in CG, MG, SG and LG, respectively, and the grade a+b sperm was remarkably lower in MG than that in CG (P<0.05), but higher in LG than that in MG(P<0.05); the grade a+b sperm accounted for (68.39±15.13), (39.96±4.89), (62.28±4.43) and (73.61±5.05)%, respectively, and it was obviously lower in MG than that in CG (P<0.05) but higher in LG than that in MG (P<0.05); the percentages of good function mitochondrion were (1105.93±0.33)%, (848.55±6.15)%, (888.77±22.46)% and (1000.885 ±72)% in CG, MG, SG and LG, respectively, and it was remarkably lower in MG than that in CG (P<0.05), but higher in LG than that in MG(P<0.05); defuctionalization mitochondrion were (27.94±0.32)%, (42.43±1.00)%, (35.11±1.23)% and (30.91±0.44)%，respectively, it was remarkably higher in MG than that in CG (P<0.05), but obviously lower in LG than that in MG(P<0.05).ConclusionIntraperitoneal injection of cyclophosphamide decreases the sperm count, percentages of grades a+b and a+b+c sperm, and the function of mitochondrion in mice, while large-doseYijingfangcan improve the above parameters, and contributes to the treatment of oligoasthenospermia.

Yijingfang; mitochondria; asthenozoospermia; mice

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.10.003

R 698.2

*通讯作者, E-mail: nanke1145@126. com