基于响应面设计的骆驼蓬总生物碱提取工艺的研究

廖天江

（甘肃工业职业技术学院 化工学院，甘肃 天水 741025）

骆驼蓬（Peganum harmalaL.）为蒺藜科（Zygophyllaceae）骆驼蓬属（Peganum）多年生草本植物，又名骆驼蒿、沙蓬豆、苦苦菜、臭草等。在我国，骆驼蓬主要分布于甘肃、宁夏、内蒙古、新疆、西藏等地，性平味苦辛，有毒，种子或全草入药，对咳嗽气喘、无名肿痛、风湿痹痛等症均有较好的疗效[1-2]。骆驼蓬作为西北地区重要的民间药，其全草含多种生物碱，具有广泛的药理作用，具有抗菌、抑制细胞免疫和体液免疫、抑制晶状体上皮细胞组织化生和增殖、抗肿瘤和一定的抗病毒等作用[3-4]。骆驼蓬生物碱具有广泛的生物活性，对心血管系统、中枢神经系统及免疫系统的作用等[5-9]。研究发现，骆驼蓬粗提物有抗肿瘤、消炎、镇痛、抗氧化酶等多方面的生物活性[10-13]。本试验为研究骆驼蓬总生物碱的提取工艺，通过响应面试验设计进行提取工艺的优选，进而得出最佳提取方案[14-16]；在提取过程中，采用超声辅助法，提高了提取率，并使产品易于纯化，保持良好的活性[17-18]。对最佳工艺下提取的骆驼蓬总生物碱进行高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定，以确定提取效果，这将为骆驼蓬这一植物资源的深层次开发利用提供了一定的理论依据和借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 药材

骆驼蓬，采自甘肃省兰州市秦王川山区，经中国科学院西北高原生物研究所赵强博士鉴定为蒺藜科（Zygophyllaceae）骆驼蓬属（Peganum）骆驼蓬（Peganum harmalaL.），除杂、自然风干、粉碎、过60目筛、备用。

1.1.2 化学试剂

骆驼蓬碱标准品：美国Sigma公司；体积分数为95%乙醇、甲醇（色谱纯）和KH2PO4（色谱纯）：德国默克MERCK公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 1100高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；UV751GD型紫外-可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；RE52-99型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；KQ-300DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；SHB-Ⅳ型双A 循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；JY型电子天平：上海方瑞仪器有限公司；SXT-06索氏提取器：上海本昂科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准工作曲线的绘制

准确配制100 mL的质量浓度为1.0 mg/mL的骆驼蓬碱标准品溶液，然后依次精确量取1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL、9 mL于100 mL容量瓶中，用去离子水稀释定容，充分振荡摇匀，得到质量浓度分别为10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80 μg/mL、90 μg/mL的骆驼蓬碱标准品的梯度溶液。分别在波长为319 nm条件下测定吸光度值，以三重蒸馏水为参比液，绘制标准工作曲线[19]。

1.3.2 骆驼蓬总生物碱提取

准确称取骆驼蓬的干燥粉末25.0 g于250 mL的烧杯中，加入相应体积分数的乙醇，在室温下封口浸泡5 h，然后进行超声振荡处理，将处理后的混合物，用索氏提取器进行回流提取骆驼蓬生物碱，回流一定的时间，将回流液经减压抽滤后进行减压浓缩，浓缩至无醇味；将浓缩液转入三角瓶中，用活性炭脱色，摇匀，封口，静置过夜，抽滤，将滤液按编号装入50 mL容量瓶，并定容，静置待测定。以骆驼蓬碱标准品为标准品，在波长319 nm处测定吸光度值，对照标准工作曲线，计算骆驼蓬总生物碱的含量。

1.3.3 响应面法优化骆驼蓬生物碱提取条件

通过文献资料的查询和课题组的研究，选取主要影响骆驼蓬生物碱提取的乙醇体积分数（%）、液料比（mL∶g）、回流时间（h）、超声时间（min）为主要的考察因素，使用Design-Expert 8.0.5软件，结合Box-Behnken中心组合进行响应面设计试验，以骆驼蓬总生物碱的含量为响应值，通过响应面分析（response surface analysis，RSA），设计4因素3水平的响应面试验，对骆驼蓬总生物碱提取条件进行优化[20-24]。

1.3.4 骆驼蓬总生物碱的HPLC测定

色谱条件：色谱柱选择为Agilent Eclipse XDB C18柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；流动相：A液为pH=2.5，浓度为0.01 mol/L的KH2PO4，B液为甲醇，洗脱比例为A∶B=6∶2（V/V）；流速为1.0 mL/min；检测波长为319 nm；温度为（25±1）℃；进样量为20 μL，在此条件下测定样品中骆驼蓬总生物碱含量，并进行回收率的计算。

2 结果与分析

2.1 骆驼蓬总生物碱的测定

图1 骆驼蓬生物碱标准曲线Fig.1 Standard curve of Harmine

通过对骆驼蓬生物碱标准品的浓度梯度溶液在波长319 nm处吸光度值的测定，以骆驼蓬生物碱标准品的质量浓度（x）为横坐标，吸光度值为纵坐标（y），得到骆驼蓬生物碱标准品的标准曲线见图1。经分析得回归方程：y=0.0054x+0.068 7，相关系数R2=0.998 6。结果表明，在10～90 μg/mL范围内，呈现良好的线性关系。

2.2 响应面试验结果分析

根据响应面试验设计进行试验，以A（乙醇体积分数）、B（液料比）、C（回流时间）、D（超声时间）为自变量，骆驼蓬总生物碱的含量为响应值（Y），进行响应面分析试验，试验结果见表1，模型方差分析结果见表2所示。

表1 Box-Behnken Design试验设计及结果Table 1 Designation and results of Box-Behnken Design

通过Design-Expert 8.0.5软件对试验结果进行分析，再经过二次回归拟合，得到试验设定的4个因素与响应值之间的模拟方程为：

表2 响应面试验回归统计分析Table 2 Regression statistical analysis of response surface methodology

由表2可知，对试验设计模型进行F值检验，结果表明，试验设计模型达到极显著水平（P＜0.019）；而失拟项同样达到极显著水平（P＜0.01）；并且，得到的决定系数R2=0.893 7；这些结果表明，试验所设计的试验模拟与实际试验比较接近，且误差较小，可以反映出各因素与响应值之间的真实内在关系[25-26]。并且，这些因素对响应值的影响非简单的线性关系，其中D、AD、A2、B2、D2均达到极显著影响水平（P＜0.01），A、C、C2达到显著影响水平（P＜0.05）。

2.3 响应面分析与优化

结合拟合函数，对回归方程模型方程绘制曲面，用以直观反映局部参数值和整体响应值的交互影响，这将便于考察各因素之间相互关系对骆驼蓬总生物碱含量影响，响应面分析结果如图2所示。

响应面的图形，是各试验因子在三维空间对响应值所构成的的曲面图，可以形象的看出各因素之间的交互作用对响应值的影响，即各因素曲线走势的陡峭程度，决定其自身对响应值影响的显著程度。由图2可知，乙醇体积分数、回流时间和超声时间的图形曲线走势较为陡，说明其对响应值的影响是较为显著的。由Design-Expert 8.0.5软件进行系统分析，结合模拟得到骆驼蓬总生物碱的提取工艺，最终确定骆驼蓬总生物碱的最佳提取工艺条件：乙醇体积分数为40.0%，液料比15.0（mL∶g）、回流时间2.3 h、超声时间10.5 min。在此工艺条件下骆驼蓬总生物碱含量为11.34%。

将此工艺下提取的骆驼蓬总生物碱样品采用HPLC进行定性检测，在1.3.4的色谱条件下进行测定，结果见图3。

图2 各因素交互作用对骆驼蓬总生物碱含量影响的响应面和等高线Fig.2 Response surface plot and contour line of interaction among each factors on total alkaloid content in P.harmala

由图3可知，标准品骆驼蓬碱的保留时间tR=7.631 min，而提取的骆驼蓬总生物碱样品保留时间tR=7.662 min；并且样品的分离较为理想，这表明骆驼蓬的提取物中含骆驼蓬总生物碱。通过对回收率的计算，得到平均回收率为98.86%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为3.92%。结果表明，通过优化所建立的骆驼蓬生物碱的提取工艺是合理的，试验方法的设计是可行的，这一工艺可以作为骆驼蓬总生物碱提取的参考条件，为骆驼蓬这一民间药材的开发和利用提供了科学的依据。

图3 标准品（A）及样品（B）HPLC检测结果Fig.3 HPLC detection results of standard（A）and sample（B）

3 结论

本研究采用响应面试验设计，分析几种因素间的交互作用，以达到较全面地反映各因素水平的效果。结果表明：骆驼蓬总生物碱最佳提取工艺条件是：乙醇体积分数40.0%，液料比15.0（mL∶g），回流时间2.3 h、超声时间10.5 min。此工艺条件下骆驼蓬总生物碱含量为11.34%。在设定的色谱条件下，平均回收率为98.76%，RSD为3.92%，表明试验方法设计合理，数据真实可靠。通过研究，为今后我国西北药用植物骆驼蓬的开发提供一定的参考依据。

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