中药益智仁盐炙对正常大鼠结肠水通道蛋白4影响研究

王 瑾，谭茂兰，汪云伟，黄勤挽

(成都中医药大学，四川 成都 611137)



中药益智仁盐炙对正常大鼠结肠水通道蛋白4影响研究

王 瑾，谭茂兰，汪云伟，黄勤挽*

(成都中医药大学，四川 成都 611137)

目的：观察益智仁盐炙对正常大鼠结肠水通道蛋白4(AQP4)的影响，研究益智仁燥性及盐炙润燥的作用机制。方法：将SPF级SD大鼠分为正常动物组、生益智仁组、盐益智仁组、清水炒益智仁组、生益智仁加盐组及生益智仁加增液汤组，各组动物每天灌胃给药1次，连续28 天。于第28天处死动物，剖取结肠组织，采用免疫组织化学检测结肠中AQP4 的表达情况。结果：与正常动物组比较，生益智仁组结肠AQP4表达显著增加(P<0.01)；与生益智组比较，盐益智仁组、清水炒益智仁组、生益智仁加盐组及生益智仁加增液汤组结肠AQP4表达均显著降低(P<0.05或P<0.01)，差异均具有统计学意义。结论：益智仁能增加正常大鼠结肠AQP4表达，促进肠道水分重吸收，从而造成便秘，体现其燥性效应；而益智仁盐炙后能降低其引起的燥性效应，其作用机制与盐炙过程中的加热炒制和辅料食盐有关。关键词：益智仁；盐炙；大鼠结肠；水通道蛋白4

益智为姜科山姜属植物益智AlpiniaoxyphyllaMiq.的干燥成熟果实，药用部位为种仁。益智仁药用历史悠久，中医传统用药经验认为其生品辛温而燥，长于温脾止泻、摄涎唾力胜；而盐炙后其辛燥之性减弱，专行下焦，长于固精、缩尿。课题组前期研究表明，益智仁对小鼠肠腔水分,特别是大肠肠腔水分有显著的减少作用，说明益智仁引起动物出现便秘症状原因之一为加强小肠、大肠肠腔水分的重吸收[1]。水通道蛋白是一类具有高度选择性的运输水的膜通道蛋白家族，在哺乳动物组织中已发现13种水通道蛋白亚型[2]，其中水通道蛋白3、4、8(AQP3、AQP4、AQP8)等在结肠中分布表达并参与结肠水分重吸收过程[3-4]。

益智仁促进肠道水分重吸收的机制是否与AQP4有关？盐炙后有何影响？影响的关键环节是什么？上述问题均无相关报道。本文观察了灌胃给予正常大鼠益智仁、盐益智仁对其结肠组织AQP4表达的影响，现报道如下。

1 材料与试剂

1.1 仪器

Motic BA400显微摄像系统(麦克奥迪公司)；倒置相差显微镜(日本OLYMPUS公司)；QYC-200型恒温摇床(上海福玛公司)；徕卡-2015切片机(德国克林蓝公司)；TSJ-Q型全自动封闭式组织脱水机、BMJ-Ⅲ型包埋机、PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪(常州市中威医疗仪器有限公司)；Image-Pro Plus图像分析系统(Media Cybernetics，Inc.公司)。

1.2 药材与供试品制备

益智AlpiniaoxyphyllaMiq.购于海南省中药材公司，经成都中医药大学中药标本中心卢先明教授鉴定为益智，符合《中国药典》2010年版相关规定，将其制备成生益智仁、盐益智仁、清水炒益智仁3种饮片，分别用70%乙醇提取，回收乙醇，分别制备成2g·mL-1、1g·mL-1药液；取部分1g·mL-1生益智仁药液，按2%(w/v)加入食盐；另购玄参、麦冬、生地3种饮片，按《温病条辨》中“增液汤”配方，煎煮浓缩至2g·mL-1药液，与2g·mL-1生益智仁药液等体积混合。上述各药液中均加入5%(v/v)吐温-80增溶。

1.3 试剂试药

AQP4(H-80)抗体(批号：ZS-20812)；a Rb IgG(H+L)/Bio抗体(生物素化山羊抗兔IgG)(批号：V0527)；a Mo IgG(H+L)/Bio抗体(生物素化山羊抗小鼠IgG)(批号：V0522)；辣根过氧化酶标记链霉素卵蛋白(HRP/A-V)(批号：V7023)；DAB显色剂(批号：753223A)，均由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。PBS缓冲液(pH7.2～7.4)：NaCl 137mmol/L、KCl 2.7mmol/L、Na2HPO44.3mmol/L、KH2PO41.4mmol/L。

1.4 动物

SD大鼠，SPF级，体重180～220g，雄性，由成都达硕生物科技有限公司提供，许可证号SCXK(川)2013-24。

2 方法

2.1 分组及给药

将大鼠按体重随机分成6组，即空白对照组、生益智仁组、盐益智仁组、清水炒益智仁组、生益智仁加盐组、生益智仁加增液汤组，每组6只。空白对照组灌胃给予纯水，益智仁各给药组分别给予相应药液，给药剂量均为20mL·kg-1。每天灌胃给药1次，连续28 天。

2.2 结肠组织制片

于第28天末次给药后1h，用水合氯醛(0.35g·kg-1)麻醉动物，行腹中线剖开，在右侧横状结肠处采集约1cm长的肠管，用4%多聚甲醛溶液固定，备APES处理的载玻片，常规石蜡切片，切片厚度约6～8μm。

2.3 结肠组织AQP4免疫组织化学检测

采用免疫组织化学的链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(S-P法)检测大鼠结肠组织AQP4蛋白表达情况。石蜡切片常规脱蜡至水，加3% H2O2溶液于玻片上，室温静置10min以清除内源性过氧化酶，用蒸馏水洗3次，每次2min。将切片浸入含0.01M枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)的容器中，置于微波炉内加热使容器内液体温度保持在92～98℃之间并持续10～15min，取出容器置于室温冷却后用PBS缓冲液洗涤2次。切片滴加5% BSA 1滴封闭，在37℃下温育20min，甩去多余液体，不洗。滴加1∶200稀释的一抗(AQP4抗体)，4℃过夜，用PBS洗涤3次，每次2min；滴加二抗(生物素化山羊抗兔IgG和生物素化山羊抗小鼠IgG)，37℃孵育30min，用PBS洗涤3次，每次2min；滴加辣根过氧化酶标记链霉素卵蛋白工作液，37℃孵育30min，用PBS洗涤4次，每次5min。DAB显色2min，蒸馏水洗涤。用苏木素轻度复染，脱水，透明，封片，显微镜观察。

2.4 阳性细胞图像分析处理

用Image-Pro Plus图像分析系统进行阳性细胞积分光密度(MD)分析。

2.5 统计学分析

3 结果

阳性产物为棕黄色至黄色颗粒，位于细胞质中，细胞浆及细胞核周围呈棕黄色者判为阳性，阴性细胞核为蓝色。与正常动物组比较，生益智仁组AQP4积分光密度显著增大(P<0.01)；与生益智仁组比较，盐益智仁组、生益智仁联用增液汤组AQP4积分光密度显著减小(P<0.01)，清水炒益智仁组、生益智仁外加盐组AQP4积分光密度显著减小(P<0.05)，差异均具有统计学意义。结果见表1和图1。

表1 益智仁盐炙对大鼠结肠AQP4积分光密度影响 ±s，n=6)

注：生益智仁组与空白对照组比较，**P<0.01；其余各给药组与生益智仁组比较，△P<0.05,△△P<0.01。

图1 大鼠结肠AQP4免疫组化结果

4 讨论

《中国药典》2010年版一部“益智”项下规定，益智仁单日用量为3～10g，若按成人日服最大用量10g、体重按50kg计算，则本实验所用生益智仁10g·kg-1的剂量相当于成人日服最大剂量的50倍。在该剂量下，连续灌胃给药正常大鼠28天，与正常动物组比较，大鼠结肠组织AQP4积分光密度显著增大，说明大鼠结肠组织AQP4表达有所加强，进而结肠组织肠道水分重吸收加强，粪便含水量降低，体现出益智仁对正常大鼠肠道的燥性效应。

益智仁经过盐炙后，能够显著降低因生益智仁导致的大鼠结肠组织AQP4表达增强效应，即能够降低生益智仁对肠道的燥性效应，体现盐炙润燥的炮制作用原理。将盐炙的关键作用环节分解为加热作用和辅料作用，通过比较仅有加热作用的样品(清水炒益智仁组)和仅有辅料作用的样品(益智仁加盐组)，发现两者与生益智仁相比，均能够显著降低因生益智仁导致的大鼠结肠组织AQP4表达增强效应，但作用强度不及盐益智仁组，故表明盐炙润燥是加热炒制和食盐辅料共同导致的协同作用。

增液汤为中医临床治疗燥证的基础方剂，将其与生益智仁联合用药，能够显著降低因生益智仁导致的大鼠结肠组织AQP4表达增强效应，起到滋阴润燥的作用，亦为本实验结果的可靠性做了验证。

[1] 刘静,黄勤挽,王瑾,等.基于正常小鼠排便作用的益智仁燥性效应表征研究[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(23):231-234.

[2] 杨文茜,潘冰冰,王云姣.水通道蛋白4的研究进展[J].中国实用医药,2009,4(20):238-241.

[3] 汪泳,张方信,令晓玲,等.大鼠结肠中水通道蛋白4的表达与分布[J].第四军医大学学报, 2004,25(2):142-143.

[4] 吴本升,杨柏霖,周锦勇,等.“养阴润肠方”对慢传输便秘模型大鼠结肠黏膜水通道蛋白3和水通道蛋白8的影响[J].江苏中医药,2013,45(4):66-68.

(责任编辑：尹晨茹)

Effect study ofFructusAlpiniaeOxyphyllae Stir-frying With Salt Water on AQP4 of Normal Rats Colon

Wang Jin,Tan Maolan,Wang Yunwei,Huang Qinwan*

(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 611137,China)

Objective:To study the effect of Fructus Alpiniae Oxyphyllae (FAO) Stir-frying with Salt Water on AQP4 of normal rats colon, so as to study the mechanism of dry effects and salt-processed moistening-dryness of FAO stir-frying with salt water.Methods:The SPF rats were divided into 6 groups: normal group, crude FAO group, FAO stir-frying with salt water and water groups, crude FAO coupled with salt group, FAO and increased liquid soup combination group. All rats were orally administered once a day for 28 d. All rats were sacrificed on the 28th day, and dissected the colon, then detected the expression of AQP4 of colon by immunohistochemistry.Results:Compared with normal group, the expression of AQP4 of crude FAO group were increased significantly(P<0.01); compared with crude FAO group, the expression of AQP4 of FAO Stir-frying with salt water and water groups, crude FAO coupled with salt group, FAO and increased liquid soup combination group were decreased significantly(P<0.05 orP<0.01).Conclusion:FAO can increase the expression of AQP4 of normal animal colon, to promote intestinal reabsorption of water, then lead to constipation and reflect its dry effects; However, FAO stir-frying with salt water can reduce its dry effects by FAO, the mechanism was related to stir-frying and salt in the process of stir-frying with salt water.

Fructus Alpiniae Oxyphyllae;Stir-frying With Salt Water; Rats Colon; AQP4

2014-02-18

国家自然科学基金(81001639)；教育部新教师基金(2010513120002)

王瑾(1983-)，女，成都中医药大学助理研究员，研究方向为中药学。

黄勤挽(1979-)，男，博士，成都中医药大学副教授，研究方向为中药炮制学。

R283;R285.5

A

1673-2197(2014)10-0010-02