经皮穴位电刺激对过度训练大鼠性腺轴的影响及机制研究

张彩,杨华元



经皮穴位电刺激对过度训练大鼠性腺轴的影响及机制研究

张彩,杨华元

(上海中医药大学,上海 201203)

观察经皮穴位电刺激(transcutanclus electrical acupoint stimulation,TEAS)对过度训练大鼠性腺轴(HPG)的调控作用,并探讨其机制。将32只雄性SD大鼠,随机分为空白对照组、造模前干预组、造模后干预组和模型组,每组8只。采用递增强度的跑台建立过度训练大鼠模型。两个干预组分别在造模前和造模后进行TEAS干预。实验结束时取全血、下丘脑、垂体、杏仁核进行检测。荧光定量PCR检测下丘脑促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone,GnRH)mRNA与垂体GnRH-R mRNA的表达;ELISA法检测黄体生成素(Luteinizing Hormone, LH)、睾酮(Testosterone,T)浓度;ELISA法检测杏仁核蛋白激酶C(Protein kinase C, PKC)、环磷酸鸟苷(cyclic Guanosine Monophosphate,cGMP)活性。与空白对照组比较,模型组垂体GnRH-R mRNA表达显著下降(＜0.05),T明显降低(＜0.05)提示实验中所采用的训练方案抑制了HPG轴的功能。造模前干预组与模型组比较,可以显著增加垂体GnRH-R mRNA的表达(＜0.05);造模后TEAS干预可以显著增加运动机体下丘脑GnRH mRNA的表达与T水平(＜0.05,＜0.01)。与模型组比较,造模前干预组可以显著提高杏仁核PKC活性(＜0.01)。造模后干预组杏仁核cGMP活性显著高于模型组(＜0.05)。过度训练大鼠HPG轴功能处于抑制状态。TEAS干预过度训练机体,可以提高HPG轴功能,但不同时间段进行干预,所影响的HPG轴的靶点有所不同。造模前TEAS干预运动机体是通过增加杏仁核PKC活性调整HPG功能,而造模后干预是通过加强杏仁核cGMP活性而调整HPG轴功能。

针刺疗法;经皮穴位电刺激;杏仁核;大鼠;过度训练;性腺轴;运动性疲劳(肌肉疲劳)

随着全球经济的飞速发展,竞技体育逐渐成为国家强盛的一个重要标志,比赛竞争越来越激烈,各个训练队、运动员为了追求成绩而不断增加训练负荷与强度,所以过度训练的现象在运动队中非常普遍。过度训练是运动负荷与机体机能不相适应,以至疲劳连续累积而引起的一系列功能紊乱或病理状态[1]。过度训练不仅会降低运动员的成绩,甚至会损伤运动机体,断送运动员的运动生涯。如何防治过度训练成为体育科学与运动医学的重要研究方向。运动与机体下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamic pituitary-gonad axis, HPG)关系密切,过度训练会抑制HPG轴功能[2-3]。而采用中药、针灸等中医手段可以调整HPG轴的功能,提高运动机能,防治过度训练的发生[2,4]。但中药存在成分不明确、口味较苦的弊端,针刺又是一种微创的干预方法,很多运动员不愿意接受。经皮穴位电刺激(transcutanclus electrical acupoint stimulation, TEAS)是将经皮电神经刺激疗法(transcutanclus electrical nerve stimulation,TENS)与针灸穴位相结合的新型针灸治疗方法,其克服了中药与针灸的弊端。本研究以过度训练大鼠为研究对象,观察TEAS对过度训练机体HPG轴的影响。并从调控下丘脑分泌功能的杏仁核内信息转导的变化[5-7],探究TEAS调控HPG轴的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD大鼠32只,清洁级,体重(250±10) g,由中国科学院实验动物中心提供,动物许可证编号[SCXK(沪2008-0016)]。训练过程中剔除出现以下两种情况的动物,①连续3 d都不能适应跑台的大鼠;②在训练过程中严重受伤的大鼠。

1.2 实验试剂

大鼠环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosph- ate,cGMP)、大鼠蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)、大鼠促黄体生成素(luteinizing hormone,LH)及酶联免疫分析试剂盒,美国R&D公司提供;大鼠血清睾酮(testosterone,T)放射免疫试剂盒,北京北方生物技术研究所提供;Trizol,美国Invitrogen公司提供;逆转录cDNA合成试剂盒,立陶宛MBI公司(Fermentas)提供;SYBR Green PCR试剂盒,捷瑞生物科技公司提供;引物设计合成,捷瑞生物科技公司提供。

1.3 实验仪器

韩氏穴位神经刺激仪(北京普康医药科技发展公司,型号LH402);六通道动物跑台(东西仪器科技有限公司,型号SLY-RTML);PCR仪(美国ABI公司,型号Step one Plus PCR);智能化g计数器(北京核仪器厂,型号FT646A3);多功能细胞定量分析仪(德国BEC KMAN公司,型号QUANTA SC);透射电子显微镜(荷兰Philips,型号Tecnai-12 Biotwin);酶标仪(美国BIO TEK公司,型号Bio-tek Synergy HT)。

1.4 实验方法

1.4.1 训练模式

参考既往过度训练方案[8-11],本课题采用跑台的运动方式,进行递增强度的模式,建立过度训练大鼠模型。大鼠适应性喂养6 d后开始训练,训练持续8星期。运动方案见表1。

表 1 大鼠过度训练模型运动方案

1.4.2 实验分组方法

32只SD雄性大鼠随机分为空白对照组、造模前干预组、造模后干预组和模型组,每组8只。空白对照组不训练、不干预,常规饲养;造模前干预组在TEAS干预2星期后,按照训练表1训练计划进行训练;造模后干预组按表1训练计划训练8星期,再进行TEAS干预2星期;模型组按表1训练方案进行训练8星期,建立过度训练大鼠模型。

1.4.3 经皮穴位电刺激干预方法

经过文献筛选,最终选择双侧后三里(后肢内踝高点直上10 mm处)与三阴交(后肢膝关节处下方约5 mm)。取穴方法参照《大鼠穴位图谱》[12]。将大鼠穴位局部毛剃除,后三里直刺7 mm,三阴交直刺5 mm。将电极固定于相应部位。治疗参数为连续波,频率为2 Hz,强度为5 mA,治疗20 min。

1.4.4 动物处理方法

实验干预后,大鼠经0.4%戊巴比妥腹腔注射进行麻醉,麻醉后左心室取血,取血后暴露心脏,左心室插管,剪开右心耳,先以生理盐水迅速灌冲,再灌注4%多聚甲醛进行固定,取出下丘脑、垂体、杏仁核,液氮保存。

1.4.5 指标检测方法

①血清T采用放射免疫法测量;②下丘脑GnRH mRNA检测采用荧光定量PCR方法,第一步为组织总RNA的抽提;第二步为逆转录cDNA。③采用荧光定量法检测垂体GnRH-R mRNA;④采用双抗体夹心法测定标本中大鼠促黄体激素(LH)水平;⑤采用酶联免疫分析(ELISA)检测cGMP与PKC。

1.5 统计学方法

采用一般描述性分析,并利用SPSS13.0进行方差分析,计量资料采用均数±标准差表示。

2 结果

2.1 各组大鼠HPG轴指标结果比较

2.1.1 各组大鼠下丘脑GnRH mRNA表达比较

造模后干预组大鼠下丘脑GnRH mRNA的表达最强,与模型组比较,差异具有统计学意义(＜0.05),提示模后进行TEAS干预能增强运动机体下丘脑分泌GnRH的趋势。详见表2

表 2 各组大鼠下丘脑GnRH mRNA表达比较 (±s)

注:与模型组比较1)＜0.05

2.1.2 各组大鼠垂体GnRH-R mRNA表达比较

模型组大鼠垂体GnRH-R mRNA表达显著低于空白对照组(＜0.05),提示该实验中的大强度训练一定程度上抑制了垂体GnRH-R基因的表达。造模前干预组大鼠垂体GnRH-R mRNA含量显著高于模型组(＜0.05),提示TEAS预刺激可以促进机体垂体GnRH-R的分泌。详见表3。

表 3 各组大鼠下丘脑GnRH-R mRNA表达比较 (±s)

注:与空白对照组比较1)＜0.05;与造模前干预组比较2)＜0.05

2.1.3 各组大鼠血清LH及血清T比较

各组大鼠血清LH含量比较,差异均无统计学意义(＞0.05)。模型组大鼠血清T含量明显低于空白对照组(＜0.05),提示本研究所采用的训练方案负荷过大,抑制了机体T的分泌。而造模后干预组大鼠血清T含量与模型组比较,差异具有统计学意义(＜0.05),提示造模后TEAS干预能提高运动机体血清T的含量。详见表4。

表 4 各组大鼠血清LH及血清T含量比较 (±s)

注:与模型组比较1)＜0.05;与空白对照组比较2)＜0.05

2.1.4 各组大鼠杏仁核内PKC及cGMP活性比较

表 5 各组大鼠杏仁核内PKC及cGMP活性比较 (±s)

注:与模型组比较1)＜0.01,2)＜0.05

模型组大鼠杏仁核内PKC及cGMP含量均低于空白对照组,但差异均无统计学意义(＞0.05),提示过度训练可能导致大鼠杏仁核内PKC及cGMP活性下降。

造模前干预组大鼠杏仁核内PKC含量与模型组比较,差异具有统计学意义(＜0.01)。造模后干预组大鼠杏仁核内cGMP含量与模型组比较,差异具有统计学意义(＜0.05)。详见表5。

4 讨论

本课题以防治过度训练为着眼点切入,采用TEAS在实验的不同时间段干预运动机体,观察TEAS对过度训练机体HPG轴各级分泌功能的影响,并研究杏仁核内信息转导的变化,探析杏仁核内信息转导的变化对HPG轴的影响。国内外研究证实运动与HPG轴关系密切[13],其中与运动关系密切的T的分泌便是由HPG轴中第三级睾丸分泌。HPG轴最上级为下丘脑,下丘脑分泌GnRH,通过垂体门脉血流到达腺垂体,与垂体上的GnRH受体结合,促进垂体分泌LH、FSH,LH经血液循环到达性腺(睾丸),调节性腺的分泌T活动,最终影响机体的运动机能。下丘脑中许多神经元具有内分泌功能,可以分泌激素。GnRH主要由下丘脑的弓状核、内侧视前区与室旁核等处分泌。GnRH的主要作用是促进腺垂体合成和分泌促性腺激素,而下丘脑GnRH mRNA表达可以直接反应下丘脑内GnRH的含量。过度训练能反馈性抑制HPG轴的功能,引起下丘脑内GnRH mRNA表达下降[14]。研究选择足三里与三阴交两个穴位,足三里为养生保健常用穴,是多气多血足阳明胃经之合穴,有调脾胃、养气血、壮机体和助消化的作用。很多研究证实针刺足三里具有缓解运动性疲劳,提高运动机能的作用[15]。三阴交属足太阴脾经,是肝经、脾经、肾经的交会穴,具有健脾、补肝、益肾的功效。沈梅红等[16]报道针刺骨折模型大鼠三阴交穴能增高血清T含量。TEAS干预足三里与三阴交,具有调补脾胃、补益肝肾的作用,可以缓解或治疗“力劳”。而HPG轴的功能与中医学“肾”的功能关系密切[17],TEAS干预机体能够增强HPG轴的各级分泌功能。

垂体上的促性腺激素细胞膜上有GnRH的受体,GnRH与受体结合后,促进下级激素表达。GnRH-R是GnRH发挥生物效应的关键介导者,任何影响GnRH受体基因表达及蛋白表达量的因素均可影响GnRH的作用,从而影响HPG轴的功能。LH是属于腺垂体分泌的激素,作用于睾丸,促进睾丸分泌T。LH则主要作用于间质细胞,LH还参与激素分泌的调节,睾丸间质细胞膜上存在LH受体。当腺垂体分泌的LH与间质细胞膜上的LH受体结合后,T合成增加。有研究提示高强度运动会抑制机体垂体分泌LH。本研究结果显示,模型组大鼠血清LH低于空白对照组,但差异无统计学意义(＞0.05),这主要是因为大负荷训练抑制垂体LH的分泌。T是一种类固醇激素,由男性的睾丸或女性的卵巢分泌,具有维持肌肉质量、维持骨质密度及强度及增强体能等作用。T可促进同化代谢,促进蛋白质的合成,使肌肉壮大,刺激红细胞合成,加速血红蛋白的合成,加速体内抗体的形成,增强免疫功能和抗感染能力。T对提高力量、速度和耐力的训练效果均有益处,血清T水平是评定运动员机能状态的重要指标。过度训练会引起T水平下降,从而引起人体的运动机能下降,所以T下降可以作为机体过度训练的标志。TEAS造模后干预,具有治疗过度训练的作用,通过调补肝肾可以提高大鼠血清T含量,促进蛋白合成,增强大鼠的免疫力,增强其运动能力的作用。综上分析,模型组大鼠垂体GnRH-R mRNA的表达显著下降,垂体分泌的LH有下降趋势,睾丸分泌的T显著下降,说明本实验的训练方案抑制了运动机体HPG轴的各级分泌功能。

在实验的不同时间段进行TEAS干预均可以不同程度的提高运动机体HPG轴各级分泌功能,但作用的靶点不同。训练前的干预,即“预刺激”,可以提高大鼠垂体GnRH-R mRNA的表达,增强垂体分泌LH与睾丸分泌T的功能。造模后TEAS干预,可以增加大鼠下丘脑GnRH mRNA的表达,提高大鼠的血清T与LH。从中医学理论分析,造模前干预,可以预先激发机体的经络之气,增强肝脾肾功能,进而提高大鼠的运动机能。而造模后干预则对过度训练大鼠具有治疗作用,通过调补肝肾,调控改善大鼠的运动机能。

目前开展的很多相关研究从海马内神经传导变化,探究各种干预措施对运动机体的影响机制。本研究从杏仁核内信息的转导,探究TEAS调控过度训练大鼠HPG轴的中枢机制之一。杏仁核通过内侧核群的神经纤维影响下丘脑功能,而HPG轴的中枢部位为下丘脑,所以杏仁核对HPG轴具有一定的调控作用。本研究观察杏仁核内PKC、cGMP的活性改变,探究TEAS调控过度训练大鼠HPG中枢机制。PKC是杏仁核信息传递的中间物质,其活性增强,提示杏仁核内信息传递增强,反之则信息传递减慢。而PKC活性下降,又会影响杏仁核内信息传导,进而抑制下丘脑分泌功能,从而抑制HPG轴功能。TEAS在不同的时间段干预过度训练机体,均可提高杏仁核PKC活性,尤其是造模前干预,PKC活性高于模型组(＜0.01),提示造模前TEAS干预训练机体,可以通过增强中枢杏仁核内PKC活性,促进杏仁核内神经递质的释放,增强神经突触可塑性与基因表达等作用,进而影响下丘脑分泌功能,增强HPG轴功能,进而最终保护运动机体避免出现过度训练。

cGMP具有信息传导作用,一般称为第二信使。cGMP可以通过调控Ca2+的浓度,影响杏仁核神经元的活性,影响下丘脑的分泌功能,最终调控HPG轴的各级分泌功能。在不同的时间段,TEAS干预运动机体,只有在造模后TEAS干预运动机体可以明显增强cGMP活性。提示造模后TEAS干预,可以提高杏仁核内cGMP活性,促进杏仁核内信息传递,加强下丘脑内分泌功能,进而增强HPG轴的各级功能,提高运动能力。

综上所述,TEAS干预运动机体可以通过调整HPG轴的各级分泌功能,防治过度训练的发生,提高运动机能,但造模前与造模后干预过度训练机体起作用的靶点与作用机制有所不同。

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Study of the Effect of TEAS on the HPG Axis and the Mechanism of Its Action in Overtraining Rats

,-.

,201203,

To investigate the regulating effect of transcutanclus electrical acupoint stimulation (TEAS) on the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and explore the mechanism of its action.Thirty-two male SD rats were randomly allocated to black control, before-model making intervention, after-model making intervention and model groups, 8 rats each. A rat model of overtraining was made by increasing intensity treadmill running. The two intervention groups were given TEAS before and after model making, respectively. At the end of experiment, the whole blood, hypothalamus, pituitary and amygdaloid nucleus were taken for examination. The expressions of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) mRNA in the hypothalamus and GnRH-R mRNA in the pituitary were examined by fluorescent quantitative PCR. Luteinizing hormone (LH) and testosterone (T) concentrations and amygdala protein kinase C (PKC) and cyclic guanosine monophosphate (cGMP) activities were measured by ELISA.The expression of GnRH-R mRNA in the pituitary and T concentration decreased significantly in the model group compared with the blank control group (both＜0.05), indicating that the training scheme used in the experiment inhibited the function of HPG axis. Pituitary expression of GnRH-R mRNA increased significantly in the before-model making intervention group compared with the model group (＜0.05). TEAS intervention after model making significantly increased hypothalamic expression of GnRH-R mRNA and T levels in the moving bodies (＜0.05,＜0.01). Compared with the model group, amygdala PKC activity increased significantly in the before-model making intervention group (＜0.01) and amygdala cGMP activity increased significantly in the after-model making intervention group (＜0.05).The function of HPG axis is in an inhibitory state in overtraining rats. TEAS intervention can improve the function of HPG axis in overtraining bodies, but the target of HPG axis it affects is different if the intervention is made in a different time period. TEAS intervention before model making regulates the function of HPG axis by increasing amygdala PKC activity and TEAS intervention after model making regulates the function of HPG axis by increasing amygdala cGMP activity in moving bodies.

Acupuncture therapy; Transcutanclus electrical acupoint stimulation; Amygdaloid nucleus; Rats; Overtraining; Hypothalamic-pituitary-gonadal axis; Exercise-induced fatigue (muscle fatigue)

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.07.0680

1005-0957(2014)07-0680-04

张彩(1979 - ),女,讲师

2014-01-28