高三尖杉酯碱增强慢性粒细胞白血病细胞对于伊马替尼敏感性的研究*

黄彬涛 赵卫红 肖 镇 高 大

高三尖杉酯碱增强慢性粒细胞白血病细胞对于伊马替尼敏感性的研究*

黄彬涛①赵卫红②肖 镇①高 大①

目的：研究高三尖杉酯碱（HHT）增强慢性粒细胞白血病（CML）细胞对伊马替尼（IM）敏感性的机制。方法：采集1例CML患者骨髓血标本，经体外筛选、克隆建立人白血病细胞株NPHA1（初治）和NPHA2（复发）。RNA干扰NPHA2细胞的EphB4蛋白表达，建立NPHA2-EphB4-sh细胞株。结果：与NPHA1细胞相比，耐IM的NPHA2细胞中EphB4过表达；在NPHA2-EphB4-sh细胞中，EphB4表达显著低于NPHA1细胞和NPHA2细胞（P＜0.001）。NPHA2细胞对IM有明显耐药性（IC50=5.45 mg/L），但NPHA2-EphB4-sh对IM敏感性增加（IC50=0.93 mg/L，P＜0.001）。HHT与IM共处理后，NPHA2细胞对IM的IC50值降至1.17 mg/L（P＜0.001）。蛋白磷酸化测定表明HHT抑制了EphB4/RhoA通路表达。结论：EphB4/RhoA是一个新的IM耐药途径。HHT通过抑制EphB4/RhoA途径，使IM治疗获得优势。

高三尖杉酯碱 伊马替尼 慢性髓系白血病

促红细胞生成素产生肝细胞受体（erythropoietin-producing hepatocyte receptors，Eph）是最大的酪氨酸激酶受体蛋白家族［1］。EphB4是受体Eph蛋白家族成员之一，在肿瘤形成、细胞间相互作用（包括细胞间连接、黏附、迁移和排斥）中均具有重要作用［2-3］。2003年Ohmine等［4］研究证实RhoA激酶信号参与了白血病对伊马替尼（imatinib，IM）的耐药。本研究组前期报道，EphB4在K562细胞株和慢性髓细胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）患者细胞株中表达水平均存在差异，对于IM产生耐药起到重要作用［5-6］，相关蛋白途径的检测发现，EphB4通过活化RhoA蛋白，产生对CML的耐药作用。

高三尖杉酯碱（homoharringtonine，HHT）广泛用于抗髓系白血病治疗［7］，近期文献报道，HHT对于单纯依赖IM不能取得遗传学缓解的CML患者，有肯定疗效［8］，HHT联合IM可以作为进展/耐药CML的一线治疗方案［9］。蛋白电泳发现［10］，在K562细胞株中，HHT能够增强DJ-1蛋白表达水平，而蛋白组学分析认为，DJ-1蛋白可以下调EphB4表达，这意味着HHT具有潜在调控EphB4表达水平的作用。那么HHT增强IM治疗敏感性的主要作用机制是否同干扰EphB4表达相关呢？本研究将进一步探讨HHT在EphB4主导的IM耐药中的角色和作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床病例与细胞株来源 本实验研究以2010年确诊的1例CML病例（76岁，男性）作为研究对象。该患者初始接受IM治疗，获得分子生物学缓解，但2年后复发。初诊和复发时起染色体核型均为46，XX，t（9；22）（q34；q11），相关突变检测未发现异常。经患者知情同意，分别采集初治和难治时骨髓血标本，体外培养、FISH荧光下分选BCR/ABL阳性表达的单个核细胞，经克隆、传代、建立NPHA1和NPHA2细胞株。

1.1.2 实验材料 羊抗人EphB4多克隆抗体（R&D，美国），抗磷酸化Rac1+Cdc42抗体（Cst，美国），鼠抗人β-actin单克隆抗体（Santa cruz，美国），低分子量蛋白Marker（20～118 kD，上海申博生物公司），低分子量DNA Marker（东洋坊公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 建立稳定低表达EphB4的NP-HA2细胞株（NPHA2-EphB4-sh） 按照既往方案［5-6］，采用ABI在线软件设计针对EPHB4的干扰序列，委托invitrogen公司合成。构建慢病毒载体，慢病毒包装感染处理组，加入3种慢病毒载体进行感染；阴性对照组，加入慢病毒空载体进行感染；空白对照组，加入300 μL培养基。流式细胞仪分选有绿色荧光蛋白表达的细胞，测定绿色荧光蛋白阳性率超过68%。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖抑制率 分别取各组细胞株，按5×104/孔的细胞浓度加于96孔培养板；根据预实验结果，分别用不同浓度的IM处理各组细胞。每个浓度组均设3个平行孔和空白对照；37℃，5% CO2环境培养24 h后，每孔加入MTT溶液，继续培养1.5 h，测量各孔OD值。实验独立重复3次。

1.2.3 RT-PCR法检测细胞株EphB4 mRNA表达提取RNA、检测总RNA纯度和浓度的检测，所提取的RNA样品的OD260/OD280的比值应在1.8～2.0之间。逆转录合成cDNA。PCR扩增目的基因EphB4片断，Primer 5.0软件设计引物序列［6］。PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像光密度分析仪记录图像并行光密度分析。

1.2.4 Western blot法检测细胞株EphB4蛋白表达灌注4%聚丙烯酰胺浓缩胶，含50 μL蛋白的溶液体积即为上样量。积沉胶电压80伏。转膜电压仍为120伏。EphB4分子量为108 kD、转膜时间120 min，β-actin分子量为43 kD，转膜时间60 min。5%脱脂乳溶液摇床封闭后，加入EphB4蛋白一抗（1：1 000），4℃摇床过夜，次日二抗（1：5 000）摇床孵育1 h。曝光、经UVP凝胶成像系统扫描，取各电泳条带的吸光度，β-actin做为内参照。

1.3 统计学分析

以SPSS 10.0软件处理。全程实验结果独立重复3次，计量资料用±s描述。依据细胞增殖抑制率，采用SPSS-Regression-probit程序计算半数抑制浓度（IC50）［10］。不同细胞株间EphB4蛋白及其mRNA检测结果比较采用单因素方差分析。若整体组间均数存在显著性差异，做多重比较。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 低表达EphB4的NPHA2-EphB4-sh细胞恢复对伊马替尼的敏感性

复发耐药的NPHA2细胞株中，EphB4 mRNA和蛋白水平均成高表达状态，RNA干扰构建的NPHA 2-EphB4-sh细胞株中，EphB4 mRNA和蛋白水平显著下降，低于NPHA1和NPHA2细胞水平（P＜0.01，图1）。MTT法检测表明，NPHA2细胞株保持着对IM的高耐药性（IC50=5.45 mg/L），而低表达EphB4的NPHA2-EphB4-sh细胞，恢复了对IM的敏感性（IC50= 0.93 mg/L，P＜0.01，表1）。

图1 不同细胞株EphB4在mRNA和蛋白水平的表达Figure 1 Expression of EphB4 mRNA and protein in cell lines

表1 NPHA细胞对伊马替尼耐药性的变化（±s）Table 1 IM resistance to change for NPhA cell（±s）

表1 NPHA细胞对伊马替尼耐药性的变化（±s）Table 1 IM resistance to change for NPhA cell（±s）

*P＜0.001,NPHA2 vs.NPHA1;**P＜0.001,NPHA2 vs.NPHA2-EphB4-sh

NPHA1 0.16±0.015 NPHA2 5.45±0.46* NPHA2-EphB4-sh 0.93±0.13** Group（n=3）IC50（mg/L）

2.2 高三尖杉酯碱能够促使复发耐药的NPHA2细胞增强对伊马替尼敏感性

流式细胞学检测示，在IM（1.2 mg/L）的孵育下，复发耐药的NPHA2细胞株凋亡率仅为2.35%±0.11%，显著低于初治的NPHA1细胞株（71.82%±1.94%，P＜0.01）。但是当HHT（浓度20 μg/L）和IM共孵育情况下，NPHA2细胞凋亡率增加到58.71%±2.39%，显著高于IM单药孵育下的NPHA2细胞凋亡率（P＜0.01，表2）。MTT测定法显示，NPHA2细胞对于IM的IC50值为5.45 mg/L；但在HHT共孵育下，NPHA2细胞对于IM的IC50值从5.45下降至1.17 mg/L（P＜0.01）。

表2 高三尖杉酯碱和伊马替尼对NPHA2细胞株凋亡的影响（±s）Table 2 Effect of HHT(20 μg/L)on the apoptosis of NPhA2 cell lines (±s)

表2 高三尖杉酯碱和伊马替尼对NPHA2细胞株凋亡的影响（±s）Table 2 Effect of HHT(20 μg/L)on the apoptosis of NPhA2 cell lines (±s)

1P＜0.001，NPhA2 cells-imatinib（1.2 mg/L）vs.NPhA1 cells-imatinib（1.2 mg/L）；2P=0.121，NPhA2 cells-imatinib（1.2 mg/L）vs.NPhA2 cells-blank control；3P=0.002，NPhA2-IM（1.2 mg/L）vs.NPhA2-imatinib（1.2 mg/L）+HHT（20 μg/L）

Group（n=3）NPhA1 cells-imatinib（1.2 mg/L）NPhA2 cells-blank control NPhA2 cells-imatinib（1.2 mg/L）NPhA2 cells-IM（1.2mg/L）+HHT（20 ug/L）P Apoptosis rate（%）71.82±1.94 2.79±0.18 2.35±0.111，2，358.71±2.39＜0.001

2.3 EphB4调控下的白血病细胞株中RhoA蛋白活性变化

在NPHA1、NPHA2和NPHA2-EphB4-sh细胞中，蛋白活性测定发现Rac1/cdc42磷酸化水平在NPHA2细胞中异常增高，但在NPHA2-EphB4-sh和NPHA1细胞中活性显著下降（P＜0.01，图2）。HHT孵育后，在NPHA2细胞株中，EphB4和Rac1/cdc42磷酸化水平显著下降（P＜0.01，图3）。

图2 不同细胞株中EphB4/Rac1/cdc42磷酸化的变化Figure 2 Phosphorylation of EphB4/Rac1/cdc42 in cell lines

图3 高三尖杉酯碱作用下不同细胞株中蛋白表达水平变化Figure 3 Expression of pathway protein after HHT incubation in cell lines

3 讨论

本实验发现，EphB4在IM耐药的NPHA2细胞中处于过表达状态。在NPHA2-EphB4-sh细胞中，EphB4低表达的同时，对IM的敏感性也部分恢复，这表明EphB4能够促进CML对IM产生耐药性。RhoA蛋白主要作用是调控细胞骨架、影响细胞迁移和生物学效应［11］。RhoA信号蛋白通过非激酶依赖途经参与IM耐药机制［12］。通过测定RhoA激酶的重要信号蛋白Rac1/cdc42磷酸化水平，结果显示Rac1/cdc42磷酸化在NPHA2-EphB4-sh细胞中明显低于NPHA2细胞。随着EphB4表达水平的变化，Rac1/cdc42磷酸化也出现相应改变，EphB4通过调控RhoA来产生非激酶依赖途径的耐药机制。

临床上HHT联合IM能够改善CML预后［13］，对于进展期单纯IM治疗效果不佳的CML患者，HHT联合IM能够提高部分患者的血液学反应、改善其预后［9］。本研究发现，HHT联合IM可以提高耐药的NPHA2细胞凋亡率和增殖抑制率。在HHT的干预作用下，NPHA2细胞中的EphB4/RhoA通路表达水平出现了显著下降。

总之，对于EphB4及其受体在白血病演进中的复杂角色仍有待探索。本研究结果显示EphB4过表达能够激活RhoA非激酶依赖的耐药途径。从作用机制上，本研究结果示HHT联合IM治疗CML的有效性原因在于，HHT通过阻断EphB4/RhoA通路来增强CML患者细胞株对于IM的敏感性。

1 Noren NK,Pasquale EB.Paradoxes of the EphB4 receptor in cancer[J].Cancer Res,2007,67(9)：3994-3997.

2 Giles FJ,O'Dwyer M,Swords R.Class effects of tyrosine kinase inhibitors in the treatment of chronic myeloid leukemia[J].Leukemia, 2009,23(10)：1698-1707.

3 Zhao WH,Huang BT.Multiple biological effects of Tyrosine kinase receptor EphB4 signals in cancer cells[J].Cancer Research on Prevention and Treatment,2012,39(4)：483-486.[赵卫红,黄彬涛.肿瘤细胞中酪氨酸激酶受体EphB4信号的多重生物学效应[J].肿瘤防治研究,2012,39(4)：483-486.]

4 Ohmine K,Nagai T,Tarumoto T,et al.Analysis of gene expression profiles in an imatinib-resistant cell line,KCL22/SR[J].Stem Cells,2003,21(3)：315-321.

5 Huang BT,Zeng QC,Zhao WH,et al.Homoharringtonine contributes to imatinib sensitivity by blocking the EphB4/RhoA pathway in chronic myeloid leukemia cell lines[J].Med Oncol,2014,31 (2)：836.

6 Huang BT,Zhao WH.EphB4 contributes to imatinib resistance in K562 cell line[J].J Clin Hematol(China),2014,27(3)：234-237.[黄彬涛,赵卫红.Eph4介导K562细胞株对伊马替尼耐药性的产生[J].临床血液学杂志,2014,27(3)：234-237.]

7 Huang BT,Zeng QC,Yu J,et al.High-dose homoharringtonine versus standard-dose daunorubicin is effective and safe as induction and post-induction chemotherapy for elderly patients with acute myeloid leukemia：a multicenter experience from China[J]. Med Oncol,2012,29(1)：251-259.

8 Marin D,Kaeda JS,Andreasson C,et al.Phase I/II trial of addingsemisynthetic homoharringtonine in chronic myeloid leukemia patients who have achieved partial or complete cytogenetic response on imatinib[J].Cancer,2005,103(9)：1850-1855.

9 Fang B,Li N,Song Y,et al.Standard-dose imatinib plus low-dose homoharringtonine and granulocyte colony-stimulating factor is an effective induction therapy for patients with chronic myeloid leukemia in myeloid blast crisis who have failed prior single-agent therapy with imatinib[J].Ann Hematol,2010,89(11)：1099-1105.

10 Li R,Liu XL,Du QF,et al.Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis analysis of apoptosis in K562 cells induced by harringtonine[J].Ai Zheng,2004,23(10)：1155-1160.

11 Harnois T,Constantin B,Rioux A,et al.Differential interaction and activation of Rho family GTPases by p210 bcr-abl and p190 bcr-abl[J].Oncogene,2003,22(41)：6445-6454.

12 Kuzelová K,Hrkal Z.Rho-signaling pathways in chronic myelogenous leukemia[J].Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets,2008, 8(4)：261-267.

13 O'Brien S,Talpaz M,Cortes J,et al.Simultaneous homoharringtonine and interferon-alpha in the treatment of patients with chronic phase chronic myelogenous leukemia[J].Cancer,2002,94(7)：2024-2032.

（2014-05-06收稿）

（2014-06-30修回）

（本文编辑：郑莉）

黄彬涛 博士，副主任医师。专业方向为肿瘤病理学。

E-mail：huangbintao1979@sina.com

·读者·作者·编者·

“肿瘤代谢与营养”有奖征文

为促进我国肿瘤代谢、营养与支持治疗的基础研究与临床应用、规范肿瘤患者的营养治疗、提高对营养治疗在肿瘤多学科综合治疗中重要性的认识，《肿瘤代谢与营养电子杂志》与中国抗癌协会肿瘤营养与支持治疗专业委员会联合举办“肿瘤代谢与营养”有奖征文活动。具体事宜如下：

一、征文要求

1.征文对象：全球临床工作者、基础研究人员及其他有兴趣的人员。

2.征文语言：中文。

3.征文内容：有关肿瘤代谢、营养与支持治疗的原创性研究或Meta分析。

4.文章要求：全文4000字左右（含参考文献），需附中、英文摘要，摘要500字（词）左右，采用第三人称撰写。摘要必须包括目的、方法、结果（列出主要数据）、结论4个部分。所有图片应为彩图，除外CT、MRI及X片。图表要求有自主知识产权。

5.投稿方式：提供完整电子版本，通过Email发送至cancernutrition@163.com。

6.截稿时间：2015年3月31日。

二、奖项设置

此次征文活动设一、二、三等奖，向获奖作者颁发证书并给予奖励，获奖论文优先在《肿瘤代谢与营养电子杂志》发表。对获奖前10名作者，全额资助参加2015年5月15-17日第三届《全国肿瘤营养与支持治疗学术会议》及第三届全国肿瘤营养优秀论文评比。

三、活动组织

1.论文评比实行匿名制，从（1）实验设计（合理，不存在明显缺陷）；（2）方法（可靠，统计方法正确）；（3）研究结果（可信，解决问题，有理论或实践意义）；（4）讨论（切题，实事求是）；（5）学术道德（无剽窃、故意造假等）；（6）英文摘要翻译6方面进行评比。

2.2015年4月30日前公布获奖结果，获奖名单将公布于《肿瘤代谢与营养电子杂志》、中国抗癌协会肿瘤营养与支持治疗专业委员会网站与中国抗癌协会网站，并抄送获奖作者单位。

3.其他未尽事宜请与石英英老师联系，电话13650878799，邮箱syy1213@126.com。

《肿瘤代谢与营养电子杂志》

中国抗癌协会肿瘤营养与支持治疗专业委员会

2014年8月30日

Homoharringtonine contributes to imatinib sensitivity in chronic myeloid leukemia cell lines

Bintao HUANG1,Weihong ZHAO2,Zhen XIAO1,Da GAO1

Bintao HUANG;E-mail:huangbintao1979@sina.com
1Department of Hematology,the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010059;2Department of Gastroenterology,theAffiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010059,China
This work was supported The Natural Science Foundation of Inner Mongolia(No.2013MS1157)and Inner Mongolia Autonomous Region Health and Family Planning Health Research Projects(No.201302059)

Objective:To investigate the mechanism responsible for homoharringtonine(HHT),which contributes to imatinib (IM)sensitivity in the chronic myeloid leukemia(CML)cell line.Methods:We established cell lines from a patient with CML at the time of first diagnosis and relapse phase,and designated the cell lines as NPHA1 and NPHA2,respectively.Stable underexpressed EphB4 cells(NPHA2-EphB4-sh)were obtained.Leukemia cell lines were incubated with HHT.The activated signal proteins in cells were tested by Western blot.Results:EphB4 was overexpressed in IM-resistant NPHA2 compared with the NPHA1 cell line.However, the expression of EphB4 mRNA and protein were significantly decreased in knockdown NPHA2-EphB4-sh cells compared with the NPHA2 and NPHA1(P＜0.001)cell lines.NPHA2-EphB4-sh cells were sensitive to IM(IC50:0.93 mg/L),and NPHA2 showed IM resistance(IC50:5.45 mg/L)(P＜0.001).However,co-stimulation with HHT+IM decreased IC50 of NPHA2 cells to 1.17 mg/L(P＜0.001).Meanwhile,phospho-Rac1/cdc42 was significantly increased in NPHA2 cells compared with NPHA2-EphB4-sh(P＜0.001). HHT blocked the expression of EphB4/RhoA.Conclusion:The overexpression of EphB4 contributed to IM resistance in CML line cells.EphB4/RhoA may be a new marker of IM resistance.HHT with IM yielded more treatment advantages than IM alone by blocking EphB4/RhoApathways.

homoharringtonine,imatinib,chronic myeloid leukemia

10.3969/j.issn.1000-8179.20140758

①内蒙古医科大学附属医院血液科（呼和浩特市010059）；②消化科

ƽ本文课题受内蒙古自然科学基金项目（编号：2013MS1157）、内蒙古自治区卫生和计划生育委员会医疗卫生科研计划项目（编号：201302059）资助

黄彬涛 huangbintao1979@sina.com