辛开苦降方对初发2型糖尿病KKAy小鼠胰岛素敏感性及糖脂代谢的影响

胡照娟 张先慧 张艳红 张冬梅 娄利霞 柳红芳

(北京中医药大学东直门医院，北京，100700)

实验研究

辛开苦降方对初发2型糖尿病KKAy小鼠胰岛素敏感性及糖脂代谢的影响

胡照娟 张先慧 张艳红 张冬梅 娄利霞 柳红芳

(北京中医药大学东直门医院，北京，100700)

目的：观察辛开苦降方干预初发2型糖尿病(T2DM)KKAy小鼠胰岛素敏感性及糖脂代谢的影响。方法：10周龄雄性初发T2DM KKAy小鼠40只按血糖值随机分为4组：模型组、罗格列酮组、辛开苦降低剂量组、辛开苦降高剂量组。正常对照组选10周龄雄性C57BL/6J小鼠10只。正常组及模型组给予0.5%羧甲基纤维素钠溶液(CMC)灌胃。各组连续灌胃给药四周后取材，测定其空腹血糖(Fasting Plasma glucose，FPG)、血清胰岛素(Fasting Insulin，FINS)、血脂，肝糖原、肝脂质含量。显微镜下观察肝脏组织形态。结果：给药四周后，与正常组相比，模型组胰岛素敏感指数(Insulin Sensitivity Index，ISI)明显降低(P<0.01)，FPG、FINS、总胆固醇(Total Cholesterol，TC)、三酰甘油(Triglyceride，TG)、游离脂肪酸(Free Fatty Acid，FFA)、肝脏TC、肝脏TG均明显升高(P<0.01)，肝糖原含量降低(P<0.01)。与模型组相比，罗格列酮组ISI好转(P<0.01)，FPG、FINS、TC、TG、FFA、TG明显降低(P<0.01，P<0.05)，肝糖原含量明显增加(P<0.01)。辛开苦降低剂量组及其高剂量组2组FINS、ISI、肝糖原含量均高于模型组(P<0.05，P<0.01)，TG水平低于模型组(P<0.05，P<0.01)；辛开苦降高剂量还能显著降低FPG、TC水平、FFA水平(P<0.05，P<0.01)。辛开苦降低剂量组还可显著降低肝脏TG水平(P<0.05)。肝脏病理显示：正常组小鼠肝脏结构正常，而模型组小鼠肝脏脂肪变性明显。罗格列酮组小鼠肝脏脂肪变性较模型组有所减轻。辛开苦降低剂量组和辛开苦降高剂量组小鼠肝脂肪变性较模型组有明显改善。结论：辛开苦降方可增加KKAy T2DM小鼠胰岛素敏感性，减轻肝胰岛素抵抗，肝糖原合成增加，从而改善血糖水平，并能降低血及肝脏脂质水平，减轻肝脏脂肪变性，有效保护肝脏组织形态结构。

辛开苦降方；2型糖尿病；KKAy小鼠；胰岛素敏感性；糖脂代谢

近年来糖尿病已经成为世界范围内日益严重的公共健康问题，中国成人糖尿病总数达9 240万，其中90%以上的患者为2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM)[1]。胰岛素抵抗及胰岛功能受损是T2DM发病的两个基本环节[2]。临床笔者以辛开苦降方治疗T2DM取得了很好的疗效[3]。前期的实验研究也进一步探讨了其作用机理，此次动物实验旨在研究辛开苦降方对KKAy小鼠FPG、FINS、ISI、血脂、肝糖原、肝脂质及肝脏组织形态学等的影响，探讨本方治疗T2DM的作用机制，为糖尿病的中医治疗提供新的思路和方法。

1 材料

1.1 动物 10周龄KKAy T2DM雄性小鼠40只，平均体重31～32 g，许可证号：SCXK2009-0004；10周龄雄性C57BL/6J小鼠10只，平均体重19～20 g，许可证号：SCXK2009-0007；均购自中国医学科学院协和动物研究所。单笼喂养于北京中医药大学东直门医院屏障级动物实验中心。

1.2 药品 辛开苦降方由柴胡、黄连、黄芩、半夏、生姜、大黄、枳实组成，由东直门医院中药颗粒药房提供，使用时由0.5%CMC配制成浓度分别为1.2 g/mL、2.4 g/mL(每mL相当于生药1.2 g、2.4 g)。4 ℃保存，灌胃前取出药液，放置常温后使用。罗格列酮(文迪雅，天津史克必成有限公司产品，批号：10035213)，研末后由0.5%CMC配制成0.067 mg/mL溶液。

1.3 饲料 普通饲料为小鼠全价营养颗粒饲料；高能量饲料为含10%猪油、10%蛋黄粉和10%葡萄糖的KKAy小鼠专用高能量饲料，其能量为20.06 kj/g；均由中国医学科学院协和动物研究所提供。

1.4 试剂与仪器 肝糖原测定试剂盒：购自南京建成生物技术公司，批号：20111215。胰岛素免疫试剂盒：北京北方生物技术研究所，批号20111120。CMC：由东直门医院重点实验室提供，加蒸馏水配置成0.5%CMC溶液。One-touch II血糖仪：美国强生公司产品；电恒温水浴箱：北京市医疗设备总厂，DN-HW-2；离心机：北京京立离心机有限公司，京立LD5-2A。全自动生化分析仪：日立2000，日立公司；胰岛素测定仪器：西安核仪器厂，XH6080。

2 方法

2.1 模型制备与分组 KKAy小鼠喂高能量饲料1周，用断尾取血法测FPG≥13.9 mmol/L者为T2DM成功模型，40只KKAy小鼠造模均符合标准。根据T2DM KKAy小鼠FPG轻重程度随机分为模型组、马来酸罗格列酮组(阳性药对照组)、辛开苦降低剂量组、辛开苦降高剂量组，每组10只。C57BL/6J小鼠喂普通饲料1周，FPG4.4～11.1 mmol/L者为正常对照组，10只C57BL/6J小鼠全部符合标准。各组动物均自由进食饮水，饲养温度均为22 ℃左右，湿度60%，一天中光照/黑暗时间为12 h/12 h。

2.2 给药方法 各给药组分别给予以上所配浓度药物，模型组及正常对照组灌服蒸馏水，均为每日灌服每100 g体重1 mL；各组小鼠从T2DM成模第2 d开始灌胃，1次/d，连续4周。

2.3 取材方法 给药4周后将各组小鼠称重、处死。处死前禁食12 h测FPG。摘眼球取血，置于37 ℃恒温水浴箱中30 min，离心后分离血清，-20 ℃冰箱中保存，待测生化指标。快速解剖，取肝脏，一部分立即放入液氮中，然后储存在-80 ℃冰箱中待分析，一部分固定、石蜡包埋、切片。

2.4 FPG、血脂及ISI测定 用葡萄糖氧化酶法测FPG，放免法测FINS浓度，脂酶法测血脂。计算ISI=1/(FPG×FINS)。

2.5 肝糖原和肝脏脂质含量测定 蒽酮法测定肝糖原含量。肝脏脂质含量测定采用储存于-80 ℃冰箱中的肝组织，经盐水冲洗，滤纸干燥后称取100～120 mg于EP管中，按一定比例加预冷的生理盐水，匀浆、离心后生化法检测。

2.6 肝脏形态学观察 动物取血处死后，取肝脏右叶同一部位肝脏组织约1 cm2，10%福尔马林液中充分固定24 h，流水漂洗后逐级乙醇脱水，石蜡包埋。5 μm厚切片，HE染色后中性树胶封片，光镜下观察。

3 结果

3.1 各组小鼠一般状况 入组约两周左右模型组及各给药组逐渐出现不同程度的反应迟钝，倦怠，行动呆滞等情况。以模型组最明显，罗格列酮组相对较轻。正常对照组表现活跃，反应灵敏。

3.2 辛开苦降方对小鼠FPG、FINS、ISI的影响 给药四周后，与正常组相比，模型组ISI明显降低(P<0.01)，FPG、FINS均明显升高(均P<0.01)。与模型组相比，罗格列酮组ISI好转(P<0.01)，FPG、FINS明显降低(P<0.01)，辛开苦降低剂量组及其高剂量组2组FINS均显著降低，ISI均优于模型组，辛开苦降高剂量组ISI接近罗格列酮组。见表1。

3.3 辛开苦降方对小鼠血脂的影响 给药4周后，与正常组相比，模型组血清TC、TG、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、FFA均明显升高(均P<0.01)。与模型组相比，罗格列酮组TC、TG、FFA明显降低(P<0.01)；HDL-C有降低，但无统计学意义；LDL-C明显降低(P<0.05)。辛开苦降低剂量组及其高剂量组2组TC、FFA水平均低于模型组，其中辛开苦降高剂量组有统计学意义(P<0.05)；TG水平2组与模型组比下降，差异均有统计学意义且高剂量组效果更明显；HDL-C、LDL-C低于模型组，均无统计学意义。见表2。

表1 各组小鼠FPG、FINS及ISI比较

注：与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，△P<0.05，△△P<0.01。

表2 各组小鼠血脂水平比较

注：与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，△P<0.05，△△P<0.01。

表3 各组小鼠肝糖原和肝脂质含量比较

注：与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，△P<0.05，△△P<0.01。

3.4 辛开苦降方对小鼠肝糖原和肝脂质的影响 给药四周后，与正常组相比，模型组肝糖原含量降低(P<0.01)，肝脏TC、肝脏TG含量均升高(P<0.01)。与模型组相比，罗格列酮组肝糖原含量增加明显(P<0.01)，肝脏TC含量降低(P<0.05)，肝脏TG水平降低但无统计学意义。辛开苦降低剂量组及其高剂量组2组肝糖原含量比模型组增加明显(P<0.05，P<0.01)，其中辛开苦降高剂量组肝糖原含量接近了罗格列酮组；肝脏TG水平2组与模型组比均下降，其中辛开苦降低剂量组效果更明显，差异有统计学意义(P<0.05)；肝脏TC水平2组均无统计学意义。见表3。

3.5 肝脏组织病理形态结果

3.5.1 肝脏肉眼观察 正常组小鼠肝脏体积较模型组小，外观呈红褐色，质地软而富有弹性，边缘锐利。模型组小鼠肝脏体积明显增大，偏黄色，边缘圆钝，质软，切面油腻感，呈典型肝脏脂肪变。

3.5.2 肝脏病理学观察 正常组小鼠肝组织HE染色后可见肝小叶结构清晰，肝细胞索以中央静脉为中心向四周呈放射状整齐排列，肝窦正常，肝细胞核居于细胞中央，形圆而清晰。模型组小鼠肝组织HE染色后可见广泛肝细胞脂肪变，中央静脉周围更明显，肝细胞肿胀呈圆形，胞质内可见大量大小不等的脂肪空泡。胞核被挤至一侧。肝小叶结构不清，肝索排列紊乱。中药药组肝组织脂肪变较模型组有改善，改善程度较罗格列酮组明显。(见图1)

图1 各组小鼠肝脏病理变化(HE染色×400)

4 讨论

中医药治疗糖尿病及其胰岛素抵抗有很多报道[4-8]，流行病学资料表明T2DM患者80%为肥胖或超重，由于现代社会不健康的生活方式，如嗜食生冷肥甘，烟酒无度，以车代步，肥胖丛生。在T2DM发病初期，患者乏力、尿多、消瘦等典型的“三多一少”症状并不突出，传统的“气阴两虚”病机认识十分局限，T2DM合并肥胖或血脂异常属“痰浊”或“痰热互结”范畴。本课题在之前研究成果基础上提出：T2DM具有郁、热、虚、损的病机发展演变规律，初发T2DM“郁的阶段”由中焦气机升降失调导致。治法为“辛开苦降”法，调畅气机，调和寒热，温脾而清心肝胃之热，属中医八法中“和解法”范畴[9]。辛开苦降方由经方半夏泻心汤与大柴胡汤加减而成，取得了较好的临床疗效[3]。

本实验选用自发形成的T2DM模型——转基因KKAy T2DM小鼠模型，这种模型发病是在遗传易感的基础上，过多的摄入高糖高脂饮食而诱发，与人类T2DM发病原因一致，是一种国际公认的理想的T2DM动物模型[10]。胰岛素抵抗(Insulin Resistance，IR)是指胰岛素作用的主要靶器官对一定剂量的胰岛素所产生的生理效应低于正常水平的一种状态，包括胰岛素的敏感性下降和反应性下降。IR是T2DM发病的重要环节，特征性表现是胰岛素抑制肝脏葡萄糖输出(HGP)的能力下降，导致肝糖生成增加，血糖升高，最终导致胰岛细胞功能衰竭和各种并发症发生。本研究发现与正常组比，模型组KKAy T2DM小鼠肝糖原含量降低，ISI明显降低，FPG、FINS、TC、TG、FFA均明显升高，提示模型组小鼠存在明显的髙糖、高脂及严重的IR。经辛开苦降方治疗后，肝糖原含量增加，ISI均明显高于模型组，辛开苦降低剂量组及辛开苦降高剂量组之间无统计学意义。同时，模型组小鼠血清TC、TG、FFA及肝脏TC、肝脏TG含量均明显升高。这可能是由于在IR状态下，激素敏感性脂酶(Hormone-sensitive Lipase，HSL)活性增强使脂肪组织释放大量的脂肪酸，过多的脂肪酸不能转化为酮体而作为原料使VLDL、TG、胆固醇在肝脏合成增加。而当进入组织的脂肪酸过多超过组织负荷时，脂质则可在肝脏及骨骼肌、胰腺胰岛、心肌等处沉积过多，反过来又可加重胰岛素抵抗[11-12]。糖脂毒性学说是目前公认的导致T2DM胰岛β细胞功能受损的主要病理机制[13-16]。在本研究中，辛开苦降低剂量组及其高剂量组血TG水平及肝脏TG水平均显著下降，辛开苦降高剂量组还能显著降低血TC、FFA水平。肝脏病理显示：正常组小鼠肝脏结构正常，而模型组小鼠肝脏脂肪变性明显。治疗各组小鼠肝脂肪变性较模型组有明显改善。推测辛开苦降中药可通过改善血清TC、TG、FFA及肝脏TC、肝脏TG水平从而减轻全身及肝脏脂毒性从而改善全身及肝脏胰岛素抵抗。其中高剂量效果更加明显。通过数据我们还发现，中药对全身及肝脏本身的TG水平改善更明显。总之，辛开苦降方可以有效改善T2DM小鼠IR，调节糖脂代谢，减轻肝脏病理损伤，然而其具体机制仍需要进一步研究。

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(2013-09-25收稿 责任编辑：徐颖)

Effects of Xinkaikujiang Formula on Insulin Sensitivity and Glucolipid Metabolism in KKAy Mice with Incipient Type 2 Diabetes Mellitus

Hu Zhaojuan，Zhang Xianhui，Zhang Yanhong，Zhang Dongmei，Lou Lixia，Liu Hongfang

(Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China)

Objective： To observe the intervention effects of XinkaiKujiang formula on insulin sensitivity and glucolipid metabolism in KKAy mice with incipient type 2 diabetes mellitus (T2DM).Methods： KKAy mice with type 2 diabetes mellitus were randomly assigned into the following four groups according to blood glucose levels： the model group，Rosiglitazone group，XinKaiKuJiang-low dose group (XK-L)，XinKaiKuJiang-high dose(XK-H) group. Ten male C57BL/6J mice (10 weeks old) served as a non-diabetic control group. The mice in the control and model groups were intragastrically administered with 0.5% sodium carboxymethyl cellulose solution. Blood and tissue samples were collected after 4 weeks of treatment. Contents of fasting plasma glucose (FPG)，fasting insulin (FINS)，blood lipid，hepatic glycogen and liver lipid were detected，and pathological morphology in liver was observed under the microscope. Results： After 4 weeks of treatment，compared with the normal group，the insulin sensitivity index (ISI) in the model group was apparently decreased (P<0.01). The levels of FPG，FINS，total cholesterol (TC)，triglyceride (TG)，free fatty acid (FFA)，liver total cholesterol and liver triglycerides were significantly increased (P<0.01). The content of hepatic glycogen was decreased (P<0.01). Compared with the model group，ISI in the Rosiglitazone group was improved(P<0.01). FPG，FINS，TC，TG，FFA，and liver total cholesterol were significantly decreased (P<0.01，P<0.05). The content of hepatic glycogen was significantly increased (P<0.01). FINS，ISI，content of hepatic glycogen in the XK-L group and XK-H group were all higher than those in the model group (P<0.05，P<0.01)，and the level of TG was lower than that in the model group (P<0.05，P<0.01). The levels of FPG，TC and FFA could also be decreased in XK-H group (P<0.05，P<0.01). The XK-L group also could significantly decrease the liver triglyceride level (P<0.05). According to hepatic pathology，the liver structures of mice in the normal group were normal，while the livers of mice in the model group had marked fatty degeneration. Compared with model group，there was a lighter fatty degeneration of livers in Rosiglitazone group，and fatty degeneration of livers was significantly improved in the XK-L group and XK-H group. Conclusion： The XinkaiKujiang formula could enhance the insulin sensitivity in KKAy mice with T2DM，reduce hepatic insulin resistance，and increase the content of hepatic glycogen，further improve blood sugar levels. It also could lower the lipid level in blood and liver，reduce fatty degeneration of livers，and protect the morphological structure of liver tissues effectively.

XinkaiKujiang formula; Type 2 diabetes mellitus; KKAy mice; Insulin sensitivity; Glucolipid metabolism

国家自然科学基金(编号：81072735)

柳红芳(1968—)，女，医学博士后，教授，主任医师，博士生导师，北京中医药大学东直门医院科研处长，研究方向：内分泌疾病中西医诊治，E-mail：lhfdoctor@sohu.com

R242;R587.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.06.027