抗肿瘤多肽蜂毒素的固相合成

李文娟，李任武，吴茂诚，王傅喆，秦丽萍，李 柏，胡宏岗 (.烟台大学药学院，山东 烟台 264005；2.第二军医大学，a.药学院有机化学教研室，b.长海医院中医系，上海 200433)

蜂毒作为一味传统中药用于治疗疾病由来已久，对自身免疫性疾病亦有较好的疗效。蜂毒素作为蜂毒主要组成成分越来越受到人们的重视。近年来，有关蜂毒及其蜂毒素抗肿瘤的机制研究取得了新进展[1, 2]。国外早有研究报道认为，蜂毒素能够影响多种细胞信号通路，可能是一种新型抗肿瘤先导化合物[3, 4]。蜂毒素由26个氨基酸残基构成, 氨基酸残基组成为: Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-NH2, 相对分子质量为2 846 u。国内外有关蜂毒素的全合成途径未曾有文献报道，本实验室首次通过固相逐步合成法对直链二十六肽蜂毒素的合成工艺进行研究。

1 仪器和试剂

1.1仪器 恒温磁力搅拌器(上海志威电器有限公司)，旋转蒸发仪(LOOYE ZX98-1);水浴锅(LOOYE ZX98-1) ;2ZX-4型旋片真空泵(上海豫康科教仪器设备有限公司) ;低温冷却循环泵(上海豫康科教仪器设备有限公司);循环水式多用真空泵SHB-IIIA(上海豫康科教仪器设备有限公司); ZF7B三用紫外分析仪(上海康化生化仪器制造厂)。

1.2试剂 Fmoc-氨基酸、Wang树脂、N,N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-羟基苯并三氮唑( HOBt )、三氟乙酸( TFA)、N,N-二异丙基乙基胺( DIPEA )、三氟乙醇(TFE)均 购自上海吉尔生化有限公司；茚三酮、哌啶、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷( DCM)、N-甲基吡咯烷酮( NMP )均为市售分析纯试剂；乙腈为色谱纯(J﹠K)。

2 合成实验

2.1蜂毒素的固相逐步合成 蜂毒素的化学合成采用Fmoc固相合成法，由羧基端向氨基端方向合成。合成工艺如下：将0.5 g Wang 树脂(0.8 mmol/g)、Fmoc-氨基酸、DIPEA(0.6 mmol)、DCM(20 ml)加入到多肽固相合成反应器中, 振荡反应2 h，随后用10 ml 哌啶:DMF(1:4)脱除氨基保护基Fmoc。随后，依次将树脂和下一氨基酸的活化酯进行反应，使用的活化试剂为HOBt/DCC(1.2 mmol/ 1.2 mmol)，反应溶剂为NMP(10ml)、DCM(10 ml)，室温下震荡反应。缩合过程中采用茚三酮定性显色监测反应进程。使用切割试剂(TFA-DCM=(19:1)(V/V) 将目标多肽从树脂上裂解下来，同时除去侧链保护基。溶液经浓缩后即得到蜂毒素粗品。

2.2蜂毒素的分析纯化

2.2.1蜂毒素粗品的纯化 蜂毒素粗品通过反相制备液相进行纯化。色谱条件：岛津公司LC-6A制备液相色谱仪。色谱柱：ODS C18柱(20 mm×250 mm, 5 μm)。流动相A为0.1% TFA/水，流动相B为0.1%TFA/乙腈，梯度洗脱：20%B(25 min)→80%B(5 min)→100%B(5 min)，流速10 ml/min，检测波长220 nm, 进样量200 μl。冻干后得到的纯品为白色固体粉末，收率为32%。HR-Q-TOF-MS：m/q[M+4H+] /4 712.450 5。

2.2.2蜂毒素粗品的HPLC纯度测定 蜂毒素粗品经纯化后，分析终产物的纯度。色谱条件：SPD-M20A型高效液相色谱仪(日本岛津公司) 。色谱柱: ODS C18柱( 4.6 mm×150 mm, 5 μm, 100 A, Hypersil)。流动相A为0.1% TFA/水，流动相B为0.1%TFA/乙腈，梯度洗脱20%B(25 min)→80%B(5 min)→100%B(5 min), 流速1 ml/min，检测波长220 nm, 进样量20 μl。经测定，本法所制备蜂毒素的纯度>97 %(图1)。

图1 蜂毒素RP-HPLC纯度检测

3 结果与讨论

3.1树脂的选择 固相合成主要基于：所要合成肽链的未端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上氨基酸作为氨基组分，经过脱去氨基保护基，并同过量的活化羟基组分反应接长肽链。重复操作(缩合→洗涤→去保护→中和、洗涤→下一轮缩合)，达到所要合成的肽链长度；最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。将固相合成与其他技术分开来的唯一特征是固相载体。固相载体并不是万能的，需根据实际情况选择使用。本实验在蜂毒素的合成中采用了Wang树脂。该树脂满足了以下条件：首先，肽链和树脂的反应位点最终可以形成蜂毒素中的酰胺结构；其次，Wang树脂对合成过程中的物理和化学条件稳定，而且可以在不断增长的肽链和试剂之间快速、不受阻碍地接触。

3.2缩合剂的使用 常用的氨基酸缩合体系有DCC-HOBt、DIC-HOBt、HATU-DIPEA、HBTU-DIPEA、PyBOP-DIPEA等。本实验中，笔者选择DCC-HOBt体系进行氨基酸缩合，主要基于以下两点理由：首先，DCC是一种廉价的缩合剂，易溶于有机溶剂，可使氨基酸在短时间内完成缩合；其次，DCC缩合的副产物DCU不溶于反应溶剂，易通过过滤除去。

3.3侧链保护基的除去 本研究选择了不同比例的TFA-DCM溶液(25%、50%、75%和90%)对树脂上的蜂毒素进行游离和保护基的脱除，最终确定了90%TFA-DCM溶液的树脂游离和保护基脱除体系。在此条件下，不仅能将多肽直接从树脂上切下，并同时将侧链保护基完全脱除。

4 结论

研究蜂毒素固相合成方法，它以Wang树脂为固相载体；HOBt/DCC 为缩合剂； NMP/DCM为反应溶剂；肽链从树脂上切下后采用90%TFA除去侧链保护基。该条件下合成的蜂毒素, 收率达32%，通过RP-HPLC分析其纯度>97%，能够满足药理学实验研究所需。本合成方法具有可行性, 操作简便、总收率高等特点，适用于各种长链多肽的合成。

【参考文献】

[1] Huh JE, Kang JW, Nam D,etal. Melittin suppresses VEGF-A-induced tumor growth by blocking VEGFR-2 and the COX-2-mediated MAPK signaling pathway[J]. J Nat Prod,2012, 75(11), 1922-1929.

[2] 高启龙, 李寒冰, 姚亚民, 等. 蜂毒素(Mel)对裸鼠骨肉瘤的抑制作用与影响肿瘤血管生成、细胞增殖和凋亡的关系[J]. 复旦学报：医学版, 2012, 39 (03): 283-288.

[3] Jo M, Park MH, Kollipara PS,etal. Anti-cancer effect of bee venom toxin and melittin in ovarian cancer cells through induction of death receptors and inhibition of JAK2/STAT3 pathway[J].Toxicol Appl Pharmacol,2012, 258(1), 72-81.

[4] Liu S, Yu M, He Y,etal. Melittin prevents liver cancer cell metastasis through inhibition of the Rac1-dependent pathway[J]. Hepatology, 2008, 47(6), 1964-1973.