银杏外种皮中染料木素的提取及分离

陈金铭 赵丽薇 庄鹏宇

(河北联合大学药学院 河北唐山 063000;①唐山职业技术学院农林工程系)

银杏是单科属种植物，原产于我国，是现存种子植物中最古老的孑遗植物，有“活化石”之称。其食用部分种核，俗称白果，药膳兼用，其根、茎、叶均可入药，具有重要的研究价值和利用价值［1］。银杏为裸子植物，其“果实”即为种子，最外层的种皮包被银杏种核，成熟时呈黄色或黄棕色，柔软多汁，具特殊的臭味，此为银杏外种皮。

近些年来，在银杏的研究进展中，国内外对银杏叶中化学成分的研究工艺和方法已经比较深入，但是相对而言，对银杏外种皮中化学成分的开发还缺乏一定的研究，本文通过对银杏外种皮进行提取和分离，得到染料木素，并对其进行薄层色谱测定，使用紫外可见光光谱测定等定性鉴别的方法加以验证。本实验为银杏外种皮的研究工艺及方法提供了一定的实验基础。

1 材料与方法

1.1 试剂 银杏外种皮，染料木素(sigma公司，纯度98%)，羧甲基纤维素钠(CMC，中国医药公司北京采购供应站)，薄层层析硅胶(GF-254，青岛海洋化工公司)，柱层析硅胶(柱层层析硅胶，烟台江友硅胶开发公司)，石油醚(天津市天力化学试剂有限公司)，乙酸乙酯(天津市天力化学试剂有限公司)，乙醇(天津市北方天医化学试剂厂)，正丁醇(天津市北方天医化学试剂厂)，甲醇(天津市天力化学试剂有限公司)。

1.2 仪器 DS-1高速组织捣碎机(上海标本模型厂)，SL-302N电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)，索氏提取器，RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，ZF-1三用紫外分析仪(上海康华生化仪器制造厂)，766-6型远红外快速干燥箱(上海三星电热仪器厂)，TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用有限责任公司)。

1.3 方法

1.3.1 前处理。银杏外种皮于60℃下烘干至恒重，用高速组织捣碎机捣碎，粉末过40目筛，取样粉30g，用滤纸包好，置于索氏提取器中，向索氏提取器的圆底烧瓶中加入140mL石油醚(沸程30～60℃)，回流脱脂6h，将残渣取出，置于通风处自然晾干，备用。

1.3.2 提取。取20g经过脱脂处理的银杏外种皮粉末置于250mL锥形瓶中，按固液比1:10的比例加入体积分数为65%乙醇液200mL，密闭条件下浸泡12h，室温下在55℃条件下旋转蒸发1h，回收乙醇，再旋转蒸干。待冷却至室温时，向其中加入100mL无水乙醇，旋转蒸发30min，可得米黄色的提取液。过滤，可得到异黄酮的乙醇溶液，将其在55℃条件下旋转蒸发回收乙醇。用80mL水饱和正丁醇溶液溶解，再用正丁醇饱和水溶液分3 次萃取(25mL，25mL，40mL)，弃去下层水层以除去糖类及色素，取上层溶液旋转蒸干，得棕黄色固体，为银杏异黄酮苷元［2］。

1.4 分离［3］

1.4.1 GF-254薄层层析板的制备。取羧甲基纤维素钠(CMC)10g溶于1000mL沸水中配制成浓度为1%的CMC液，取上清液与薄层层析硅胶按约30mL:10g的比例混和调匀，待无气泡时将调好的层析硅胶均匀铺在洁净的玻璃板上，放置于水平台上自然晾干。将晾干的薄层板置烘箱中110℃活化30min，将活化好的GF-254薄层层析板置干燥器中备用。

1.4.2 洗脱剂(展开剂)的选择。采用乙酸乙酯，氯仿:乙酸乙酯=1:1，氯仿:甲醇:乙酸=10:1:0.1分别做层析液，用染料木素标准品及上步提取的样品在活化好的硅胶GF-254板上点样，定距展开。风干后，在ZF-1三用紫外分析仪于254nm下照射，观察斑点的颜色，经计算斑点的比移值乙酸乙酯Rf为(0.57，0.13)，氯仿:乙酸乙酯 =1:1 Rf为(0.44，0.26)，氯仿:甲醇:乙酸=10:1:0.1 Rf为(0.31，0.18)，符合要求的展开剂为乙酸乙酯。

1.4.3 硅胶柱的制备［4］。根据样品的质量选择色谱柱的规格为φ20mm×600mm。取柱层析硅胶150g置于烧杯中，110℃活化1h，用加入一定量的洗脱剂，浸泡后超声提取1h以除去气泡。将色谱柱(φ40mm×400mm)垂直固定在支架上，在玻璃柱底端加入脱脂棉，使其成为一个表面平整的薄层，并加入少量的洗脱剂浸泡。沿玻璃棒加入硅胶，一边沉降一边加入，并且在色谱柱的管外轻轻给予敲打，使硅胶均匀地沉降，用洗脱剂洗脱至回收液无残渣。

1.4.4 样品的加入。将2g银杏异黄酮样品用少量的甲醇溶解，加入3g硅胶，置于蒸发皿中，在水浴锅上蒸除溶剂至成“细沙流状”。将样品均匀的加到硅胶柱中使其均匀沉降。

1.4.5 展开与洗脱。当样品溶液全部沉降后，打开活塞将液体徐徐放出，当液面与柱面相平时，缓缓加入洗脱剂，使洗脱剂的液面高出柱面约10cm。在层析的过程中逐步增加洗脱剂洗脱，用试管收集流份，每管收集10mL。

1.4.6 薄层层析。将各试管的流份在活化好的硅胶GF-254板上点样，以乙酸乙酯为展开剂，定距展开。风干后，在ZF-1三用紫外分析仪于254nm下照射，观察斑点的颜色并计算斑点的比移值Rf。

1.4.7 紫外吸收峰。以甲醇作为对照，取0.5mL各试管流份，用适量甲醇稀释，并将染料木素标准品将甲醇稀释，在波长200～600nm，吸光度0～3下测定紫外可见光光谱。

2 结果

2.1 柱层析分离结果 经过薄层色谱展开后，试管6～15管的Rf为0.54，有紫色荧光斑点，即为分离得到的染料木素。

2.2 紫外可见光光谱鉴定结果 紫外可见光光谱测定，由于不知银杏外种皮流分与染料木素标准品溶液的具体浓度，在用甲醇溶液不断稀释的过程中，得到两个峰形基本一致的图谱，因此可初步判定银杏外种皮中含有染料木素。

2.3 通过柱层析分离得到的流分，再用薄层色谱和紫外可见光光谱测定的结果，最终可初步判定银杏外种皮中含有染料木素。

3 讨论

①本实验用了3种洗脱剂进行对比，乙酸乙酯为展开剂的各成分斑点间的距离较远，即每两种成分的比移值差距较大，所以相对来说用乙酸乙酯做洗脱剂可以更好地分离。②在进行薄层色谱分离时，由于各种原因，比移值并不是非常精确，例如22管的成分为过渡成分，比移值表现并不明显，而在紫外吸收可见光光谱中表现明显，更为精确。③为了更准确地鉴定出银杏外种皮中含有染料木素，由于用常规的一次硅胶柱色谱需要反复进行分离，容易造成的样品损失及大量时间的浪费。所以可以采用重结晶技术，从银杏叶提取物的水解物中提纯出染料木素。④染料木素具有降低血糖的作用，如此，通过对银杏外种皮中染料木素的提取分离，就找了含染料木素的新药用植物，这样就扩大了新药源。此外，染料木素还具有诱发细胞程序性死亡、提高抗癌药效、抑制血管生成等作用，是一种很有潜力的癌症化学预防剂，其抗癌作用及机制具有广泛的应用前景。

［1］陈 鹏.银杏产业提升和可持续发展［M］.北京:中国农业科学技术出版社，2002.28-30

［2］高俊涛，赵春燕.大豆异黄酮的研究进展［J］.第四军医大学吉林军医学院学报，2005，26(1):56

［3］罗 虹，刘 鹏，李燕丹.大豆异黄酮苷元提取工艺的研究［J］.浙江师范大学学报(自然科学版)，2005，28(4):45

［4］裴月湖，孔令义.天然药物化学实验指导［M］.第2版.北京:人民卫生出版社，2005.23-25