p38MAPK信号通路与肠缺血再灌注损伤

吴 丽 李筠璐 王艳蕾

(河北联合大学基础医学院 河北唐山 063000)

肠缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤是外科临床实践中常见的组织损伤之一，在严重感染、创伤、休克、心肺功能不全等疾患的病理过程中起重要作用。早在20世纪50年代Lillehei就提出小肠是休克向不可逆发展的枢纽器官。p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38MAPK)为丝裂原活化蛋白激酶信号通路中三个主要的亚家族之一，是介导细胞因子及应激刺激导致细胞凋亡、分化及炎症反应的重要细胞内信号转导途径［1］。大量文献证实p38MAPK在缺血再灌注损伤中活化，并引起组织器官结构和功能的变化。本文就p38MAPK信号通路在肠缺血再灌注损伤中的作用作一综述。

1 p38MAPK的概述

1.1 p38MAPK的发现、分型与分布 p38MAPK于1993年由Brewster等［2］发现，是360个氨基酸残基组成的38kD的蛋白质。1994年Han等［3］用高渗和内毒素刺激小鼠肝脏细胞，分离纯化出分子量为38kD的酪氨酸磷酸化蛋白激酶—p38MAPKs，并从小鼠肝细胞cDNA文库中筛选到编码p38MAPK的基因。研究发现，p38MAPK 家族包括 p38α、p38β、p38γ、p38δ 4 种异构体亚型，它们的分布具有组织特异性。p38α表达广泛，在白细胞、肝、脾、小脑、骨髓、甲状腺、胎盘中都有较高水平的表达;p38β在脑和心脏中含量丰富;p38γ主要存在于骨骼肌;p38δ大量存在于肺、肾、肠、唾液腺的表皮细胞及睾丸、卵巢、垂体、肾上腺。

1.2 p38MAPK信号通路的激活 p38MAPK信号通路通过多级激酶的级联反应把细胞外信号向细胞内传递，其中需要3个关键激酶:MAPK、MAPK激酶(MAPKK)、MAPKK激酶(MAPKKK)。细胞受到刺激后首先激活 MAPKKK，其下游激酶 MAPKK通过氨基末端的特定序列与活化的 MAPKKK结合后被激活，活化后与MAPKKK解聚，转而结合 MAP使之活化，从而激活p38MAPK通路。p38MAPK信号通路的上游激活物是MKK3(即MAPKK3)、MKK4和MKK6，其中MKK4能同时激活JNK，而MKK3、MKK6 仅特异激活 p38MAPK［4］。除了 MAPKKK →MKK3/MKK6→p38MAPK级联反应路线外，还存在一条不依赖MKK机制的自身磷酸化途径，p38α能够在转录生长因子-β(TGF-β)激活的蛋白激酶1结合蛋白［TGF-β-activated protein kinase 1(TAK1)-binding protein;TAB1］的帮助下完成自身磷酸化过程。

1.3 p38MAPK信号通路激活后效应 在各种应激因素如紫外线、H2O2、热休克和缺氧等、炎性因子(TNF-α、IL-l和TGF-β等)及LPS和革兰氏阳性细菌细胞壁成分作用下，p38MAPK酪氨酸/苏氨酸发生双磷酸化而激活，活化的p38MAPK移位进入细胞核，通过磷酸化转录因子来调节效应基因的表达。p38MAPK信号通路控制多种转录因子的激活，如磷酸化转录因子2(activated transcription factor-2，ATF-2)氨基端活化区域69与71位的苏氨酸，导致其转录活性升高，与靶基因顺式元件结合，从而调节包括TNF-α、IL-1、IL-6和iNOs等多种炎性细胞因子的基因表达及蛋白合成;另一方面，TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等炎性细胞因子反过来又激活p38MAPK信号通路［5］，产生逐级放大的炎症级联反应。激活的p38MAPK信号通路主要参与调控细胞增殖、分化与凋亡、炎症反应等病理生理过程［6］。

2 p38MAPK信号通路与肠缺血再灌注损伤

由于肠道代谢活跃、黏膜血管结构呈发夹状，使肠道成为内脏中对I/R损伤最敏感的器官。肠缺血再灌注导致组织氧供需失衡，肠黏膜屏障受损，肠内细菌毒素移位，激活单核/巨噬细胞系统，合成、释放大量炎性细胞因子，引发肠道局部或全身性不可控制的炎症反应和促炎介质的过度释放，触发全身炎症反应，甚至多器官功能衰竭(multisystem and organ failure，MSOF)。研究表明，氧化应激、小肠黏膜屏障破坏致细菌内毒素移位、炎性细胞因子的释放、细胞凋亡等在肠I/R损伤中起着重要作用。而p38MAPK信号通路与这些机制都有或多或少的联系。

2.1 p38MAPK与氧化应激 氧化应激是肠I/R损伤的一个主要的损伤机制。I/R时小肠缺血、缺氧，细胞内大量ATP经腺苷转化为次黄嘌呤，再灌注后，氧供增加，次黄嘌呤氧化为黄嘌呤，富含黄嘌呤氧化酶的肠上皮细胞将黄嘌呤氧化，产生大量氧自由基;而肠组织中含有丰富的不饱和脂肪酸，最易发生脂质过氧化反应，从而破坏肠黏膜细胞的结构，导致线粒体肿胀，钠钾泵失灵，细胞内钠水潴留，进而引发肠黏膜屏障功能损害及通透性增加［7］。p38MAPK信号通路是调控机体应激和炎症反应的重要通路。研究发现，氧自由基参与p38MAPK的活化。刘文军等［8］观察肾I/R早期以及应用自由基清除剂tempol清除ROS后p38MAPK活化情况，发现缺血再灌注早期p38MAPK很快被诱导活化，45min达到峰值，给予ROS清除剂可以明显抑制p38MAPK的活化，表明p38MAPK信号通路的激活与氧自由基产生有关。尽管大量研究证实活性氧，如过氧化氢等，能激活p38MAPK，但其确切机制尚不完全清楚［9］。

2.2 p38MAPK与肠黏膜屏障功能 肠黏膜屏障是机体防御肠道有害刺激的第一道防线，在维持肠黏膜完整性、维持内环境稳态等方面有重要作用。肠I/R可引起肠道缺血、缺氧性损害，导致肠黏膜屏障破坏，引起细菌和内毒素移位，诱导全身过度、失控、自毁的炎症反应，导致全身炎症反应综合征，甚至多器官功能衰竭。肠黏膜屏障主要包括肠道机械屏障和免疫屏障两部分。肠黏膜屏障的破坏是发生细菌移位、肠源性感染的重要原因［10］。肠I/R时，各种损伤因素可通过细胞膜受体介导，激活p38MAPK信号通路。研究发现，p38MAPK激活时间及程度与缺血再灌注肠损伤时间、程度一致。再灌注后6h，可见肠绒毛大量脱落，炎细胞浸润，肠道组织结构破坏。Zheng等［11］在Wistar大鼠肠I/R实验中发现，再灌注30 min小肠组织p38MAPK即达活化高峰，p38MAPK活化促进肠上皮细胞凋亡，破坏肠黏膜屏障功能。Waetzig等［12］报道了 MAPKs信号转导通路的ERK1/ERK2、JNK/SAPK、p38MAPK参与炎症性肠疾病(IBD)的肠黏膜损伤。在IBD导致肠黏膜上皮损伤过程中，p38 MAPK(α)、JNK和ERK1/ERK2均被激活，其中p38 MAPK(α)活性变化最明显。Costantini等［13］发现Bal b/c小鼠全层皮肤30%造成严重烧伤能激活肠组织p38MAPK，紧密连结蛋白肌球蛋白轻链激酶 (myosin light chain kinase，MLCK)表达增加，导致肠屏障功能破坏，肠通透性增加，应用SB203580抑制p38MAPK的活化明显减轻严重烧伤引起的肠黏膜屏障功能障碍。

2.3 p38MAPK与炎性细胞因子 肠I/R损伤后，由于缺血致肠道黏膜屏障功能丧失，使肠内细菌、内毒素移位至全身。血液循环中的内毒素与脂多糖结合蛋白(LBP)结合，再与单核/巨噬细胞表面的受体CD14分子结合形成复合物。复合物与TLR4受体富含亮氨酸重复序列(LRR)的胞外区结合，触发细胞内信号传递，激活单核/巨噬细胞系统，产生一系列细胞因子［14］。肠道是最早产生细胞因子的部位，活化的巨噬细胞是TNFα的主要来源，大量的巨噬细胞存在于小肠黏膜固有层，因此，小肠有产生TNFα的巨大潜力。TNFα能激活中性粒细胞等炎性细胞，释放大量介质如氧自由基、蛋白酶等，介导小肠组织细胞损伤;它还可诱导IL-1、IL-6、IL-8等其他细胞因子的瀑布样释放。细胞因子是一个“大家族”，由复杂的网络系统所调节。一旦一种细胞因子产生，就能促进它自身和其他细胞因子的生成，并形成级联和扩展。p38MAPK通过磷酸化被激活后，可进入细胞核，通过磷酸化而激活多种转录因子，对多种靶基因的表达进行调控，其中包括IL-6、IL-1、TNFα等促炎性细胞因子。所以，在调控细胞因子产生的机制中，p38MAPK起着类似“开关”的作用，如果抑制该信号通路，可能就会抑制促炎性细胞因子的产生，从而缓解炎症过程。Aqrawal等［15］研究发现刺激人外周血B细胞后，可致细胞内p38MAPK激活，抑制这一过程可减轻甚至完全阻断细胞内TNFα等炎性细胞因子的产生，说明炎症反应中TNFα等炎性细胞因子的产生与p38MAPK激活密切相关。实验证实p38MAPK活化后不仅可增强TNF-α等炎性细胞因子的表达，而且不断增加的炎性细胞因子又通过正反馈，进一步促进p38MAPK的活化和表达，从而诱导各种凋亡调控因子的产生，导致组织细胞的凋亡和坏死，加重组织损伤［16］。

2.4 p38MAPK与细胞凋亡 细胞凋亡(apoptosis)，又称程序性细胞死亡，是一种由基因调控的细胞主动而有序死亡的过程，是近几年生物医学领域的研究热点之一。目前认为，细胞凋亡与临床上许多疾病的病理机制密切相关。它不仅在自身免疫疾病、肿瘤、衰老等病理现象中起着重要的作用，而且在器官移植领域的缺血/再灌注损伤中也起到十分重要的作用，细胞凋亡是脏器、组织在缺血/再灌注期间的一种普遍现象。肠I/R不仅造成肠道组织的坏死，还可通过多种途径引起肠道局部组织和远隔器官的细胞出现凋亡性改变［17］。适度的细胞凋亡是维持机体细胞适量稳定的重要机制，而凋亡过度则会造成机体损伤。大量研究表明，p38MAPK信号通路在多种应激刺激条件下激活，诱导细胞凋亡，阻断p38MAPK级联不仅能减轻炎症反应，还可减轻缺血再灌注损伤［18］。实验证实应用SB203580特异性抑制p38MAPK的活性，无论在体外还是体内都有很强的抗凋亡的作用，能阻断p38MAPK对下游基因的调控，减少凋亡调控因子的产生［19］。刘永芳等［20］研究发现，小肠I/R后造成p38MAPK通路的大量激活，诱导凋亡调控因子表达上调，从而使小肠组织细胞呈现凋亡的趋势;给予p38MAPK途径抑制剂后，能显著减轻小肠组织细胞的凋亡。目前认为，p38MAPK主要通过以下途径调控细胞凋亡:①增强c-myc表达;②磷酸化p53;③参与Fas/Fasl介导的凋亡;④激活c-jun和c-fos;⑤诱导Bax转位;⑥增强TNF表达而诱导凋亡。

［1］Sigala I，Zacharatos P，Toumpanakis D，et al.MAPKs and NF- κB differentially regulate cytokine expression in the diaphragm in response to resistive breathing:the role of oxidative stress［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2011，300(5):R1152

［2］Brewster JL，De Valoir T，Dwyer ND，et al.An osmosensing signal transduction pathway in yeast［J］.Science，1993，259(5102):1760

［3］Han J，Lee JD，Bibbs L，et al.A MAP kinase targeted by endotoxin and hyperosmolarity in mammalian cells［J］.Science，1994，265(5173):808

［4］Zarubin T，Han J.Activation and signaling of the p38 MAP kinase pathway［J］.Cell Res，2005，15(1):11

［5］Stjernberg-Salmela S，Ranki A，Karenko L，et al.Low TNF-induced NF-kappaB and p38 phosphorylation levels in leucocytes in tumour necrosis factor receptor-associated periodic syndrome［J］.Rheumatology，2010，49(2):382

［6］Cuenda A，Rousseau S.p38 MAP-kinases pathway regulation，function and role in human diseases［J］.Biochim Biophys Acta，2007，1773(8):1358

［7］张 华，陈聪德，李仲荣，等.兔肠缺血/再灌注损伤的超微结构改变及红花的保护作用［J］.中国应用生理学杂志，2009，25(4):472

［8］刘文军，贾一韬，夏照帆，等.大鼠肾缺血再灌注损伤后p38丝裂原活化蛋白激酶的活化及氧自由基清除剂对其影响［J］.第二军医大学学报，2008，29(2):167

［9］Son Y，Kim S，Chung HT，et al.Reactive Oxygen Species in the Activation of MAP Kinases［J］.Methods Enzymol，2013，528:27

［10］Saito T，Unno N，Yamamoto N，et al.Intraperitoneal administration of hyperbarically oxygenated perfluorochemical enhances preservation of intestinal mucosa against ischemia/reperfusion injury［J］.Shock，2006，26(6):620

［11］Zheng SY，Fu XB，Xu JG，et al.Inhibition of p38 mitogen-activated protein kinase may decrease intestinal epithelial cell apoptosis and improve intestinal epithelial barrier function after ischemia-reperfusion injury［J］.World J Gastroenterol，2005，11(5):656

［12］Waetzig GH，Seegert D，Rosenstiel P，et al.p38 mitogen activated protein kinase is activated and linked to TNF alpha signaling in inflammatory bowel disease［J］.J Immunol，2002，168(10):5342

［13］Costantini TW，Peterson CY，KrollL，et al.Role of P38MAPK in burninduced intestinal barrier breakdown［J］.J Surg Res，2009，156(1):64

［14］Hommes DW，Peppelenbosch MP，van Deventer SJ.Mitogen activated protein(MAP)kinase signal transduction pathways and novel antiinflammatory targets［J］.Gut，2003，52(1):144

［15］Aqrawal S，Gollapudi S，Su H，et al.Leptin activates human B cells to secrete TNF- α，IL-6，and IL-10 via JAK2/STAT3 and p38MAPK/ERK1/2 signaling pathway［J］.J Clin Immunol，2011，31(3):472

［16］Yamaquchi K，Kawahara T，Kumakura S，et al.Effect of olprinone，a phosphodiesterase III inhibitor，on hepatic ischemia-reperfusion injury in rats［J］.Shock，2010，33(4):436

［17］Varga J，Stasko P，Tóth S，et al.Morphological and apoptotic changes in the intestinal mucosa and lung parenchyma after ischaemic/reperfusion injury of the jejunum［J］.Acta Vet Hung，2010，58(2):243

［18］Mukhopadhyay P，Rajesh M，Horváth B，et al.Cannabidiol protects against hepatic ischemia/reperfusion injury by attenuating inflammatory signaling and response，oxidative/nutritive stress，and cell death［J］.Free Radic Biol Med，2011，50(10):1368

［19］Lim S J，L ee YJ，Lee E.p38MAPK in hibitor SB203580 sensitizes human SNU-C4 colon cancer cells to exisulind-induced apoptosis［J］.Oncology Reports，2006，16(5):1131

［20］刘永芳，刘志刚，秦 丹，等.SB203580对肠缺血再灌注大鼠p38MAPK及细胞凋亡的影响［J］.中国误诊学杂志，2010，10(12):2778