利用酶抑制速测仪检测桑叶农药残留方法探讨

董久鸣 陈伟国 孙海燕 杨一平 张 芬

(1浙江省农技推广中心，杭州 310020;2海宁市蚕桑技术服务站，浙江海宁 314400)

桑园及周边农作物使用农药污染桑叶极易导致养蚕中毒损失，如何快速、有效检测桑叶中农药残留是保障蚕桑生产安全的重要措施。农药残留检测方法有气相色谱法、液相色谱法、薄层色谱法翻，但仪器昂贵、处理繁琐、耗时较长，对仪器的使用条件和操作人员的要求比较严格，只适用于实验室检测。近年来，随着对快速检测方法的需求，以酶抑制法为代表的快速检测方法因具有高效、快捷、经济、实时、现场、覆盖率高等特点得到迅速发展，已在蔬菜、水果等农产品质量安全监管中得到广泛应用，检测对象为目前使用量最大的有机磷和氨基甲酸酯两大类农药。已被国家标准GB/T 5009.199—2003《蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测》、GB/T 18630—2002《蔬菜中有机磷及氨基甲酸酯农药残留量的简易检验方法酶抑制法》和农业行业标准NY/T 448—2001《蔬菜上有机磷和氨基甲酸酯类农药残毒快速检测方法》所采用。目前，国内市场上已有20多家生产商研制的具有农药残留快速检测功能的仪器装备40多种［1-5］。近年来，我们将农药残留速测仪应用于桑叶农药残留的快速检测，以探索蚕桑生产安全防范的新措施。

1 酶抑制率法检测农药残留的原理

利用有机磷和氨基甲酸酯类农药对动物体内乙酰胆碱酯酶(AChE)具有抑制作用的原理，在AChE及其底物乙酰胆碱(ACh)的共存体系中加入检测样品的提取液，如果样品中不含有机磷或氨基甲酸酯类农药(或残留量低)，酶的活性就不被抑制，ACh就会被酶水解，水解产物与加入的显色剂反应产生黄色物质;反之，如果检测样品的提取液中含有一定量的有机磷或氨基甲酸酯类农药，酶的活性就被抑制，试样中加入的底物就不能被酶水解，当加入显色剂时就不显色或颜色变化很小。用分光光度计在412nm 下测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率，通过抑制率可以判断出检测样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在［2，6］。抑制率计算公式如下:

抑制率(%)=［(ΔAo-ΔAt)/ΔAo］×100

式中:ΔAo—空白对照溶液反应3min 吸光度的变化值，ΔAt—检测样品溶液反应3min 吸光度的变化值。

2 试剂与仪器

2.1 仪器

分光光度计或相应的农药残毒快速检测仪，常量天平，冰箱，振荡器。

2.2 试剂

缓冲溶液 11.9g 无水磷酸氢二钾与3.2g 磷酸二氢钾，用1 000mL 蒸馏水溶解。

显色剂 160mg 二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)和15.6mg 碳酸氢钠，用20mL 缓冲溶液溶解，4℃冰箱中保存。

底物 25.0mg 硫代乙酰胆碱，加3.0mL 蒸馏水溶解，摇匀后置4℃冰箱中保存备用。保存期不超过两周。

乙酰胆碱酯酶 根据酶的活性情况，用缓冲溶液溶解，3min 的吸光度变化ΔAo 值应控制在0.3 以上。摇匀后置4℃冰箱中保存备用，保存期不超过4 天。

各种农药残毒快速检测仪生产商均可供应相应的试剂和配制方法。

3 检测方法

3.1 空白对照测试

将2.5mL 缓冲溶液加入试管中，再加入0.lmL酶液、0.1mL 显色剂、0.lmL 底物，迅速摇匀后倒入比色皿，立即放入仪器比色池中，记录反应3min 的吸光度变化值ΔAo。

3.2 样品处理

选取有代表性的桑叶样品，用清水冲洗表面尘泥，剪成1～2cm 宽的长方条，称取1g 样品，放入提取瓶中，加入5mL 缓冲溶液，振荡1～2min 后静置待用。

3.3 样品溶液测试

在试管中加入2.5mL 样品提取液，其它操作与空白对照溶液测试相同，记录反应3min 的吸光度变化值ΔAt。

3.4 检测结果的判定

检测结果以酶被抑制的程度(抑制率)表示。当检测样品提取液对酶的抑制率≥50%时为阳性，表示样品中有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药存在;当检测的抑制率≤50%时为阴性，表示样品中有机磷或氨基甲酸酯类农药不存在或含量很低。目前使用的农药残留快速检测仪大多具有检测结果自动判定显示功能，抑制率≥50%时显示为不合格，抑制率≤50%时显示为合格。

4 酶抑制法快速检测桑叶农药残留应用前景

酶抑制率检测方法的优点主要是前处理简单、检测时间短，所需仪器和试剂价格低廉，特别适合在短时间内对大批样品的筛选检测。目前，农贸市场和无公害农产品生产基地大多已配备此类检测设备。但在应用于桑叶农药残留检测时，尚需结合蚕桑生产特点。

4.1 检测对象的局限性

酶抑制法只能检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留，不能检测有机氯、拟除虫菊酯、抗生素等其它农药。因此，以酶抑制法的检测结果并不能作为对家蚕安全的唯一依据，当然在明确检测有机磷和氨基甲酸酯类农药的情况除外。

4.2 检测结果的适用性

不同植物的组织液、次生物质、叶绿素等都会干扰酶的反应，改变吸光度，影响检测结果［7-8］。GB/T 5009.199—2003 是针对蔬菜样品，以抑制率≥50%为阳性结果，表示农药残留超标(不合格)。但这一判定标准是否适用于桑叶上农药残留量对家蚕生物毒性的评判尚需进一步验证。

4.3 检测方法的可行性

尽管酶抑制法快速检测桑叶农药残留存在一些不足，但并不能否定其应用价值。GB/T 5009.199—2003 中规定了酶抑制率法对部分农药的检测灵敏度指标，如辛硫磷为0.3mg/kg，敌百虫为0.2 mg/kg，灭多威为0.1mg/kg;而这些农药对家蚕的急性毒性(LC50)为辛硫磷0.887 2 mg/L、敌百虫11.120 0mg/L、灭多威9.200 9mg/L［9-10］。可见，酶抑制率法对部分有机磷和氨基甲酸酯类农药的检出限明显低于其对家蚕的急性毒性，因此，作为预知检测手段具有可行性。

4.4 需要解决的主要问题

一是探索针对桑叶特点的检测方法，减少各种干扰因素，上提高检测准确度和可靠性。桑叶表面尘土对透光度的影响，桑叶样品提取过程中组织液渗出的多少，不同部位桑叶的叶绿素差异，多种因素都有可能对比色结果产生干扰。需要经过大量对比试验，提出适用性较强的优化检测方法，降低出现假阳性现象。

二是建立有机磷和氨基甲酸酯类农药主要品种的残留检测结果与对家蚕的生物毒性对应数据库。由于各种农药的内吸、挥发、降解等性质差异，在桑叶上的残留量和降解时间相差极大，对家蚕的毒性等级也不一样。因此，利用酶抑制法快速检测桑叶中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留结果必须与对家蚕的残毒期生物测定相对应，对主要的农药品种建立比对数据库，对检测结果提出校正参考值。

三是正确应用好酶抑制检测技术，为预防家蚕农药中毒提供有效的辅助手段。应当认识到引起家蚕农药中毒的复杂性，和酶抑制检测技术的局限性，因此要扬长避短，发挥优势。目前有机磷和氨基甲酸酯类农药约占70%［1］，在危险时期、危险区域，对桑叶农药残留进行快速筛查，并结合生物试验，可有效降低家蚕中毒风险，促进蚕桑生产稳定，使传统产业继续为农业增效、农民增收发挥积极作用。

［1］栾云霞，李杨，平华等.基于酶抑制法的农药残留快速检测仪器现状及评价［J］.食品安全质量检测学报，2012，3(6):690-694.

［2］GB/T.5009 199—2003.蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测［S］.2003.

［3］GB/T 18630—2002.蔬菜中有机磷及氨基甲酸酯农药残留量的简易检验方法酶抑制法［S］.2002.

［4］NY/T 448—2001.蔬菜上有机磷和氨基甲酸酯类农药残毒快速检测方法［S］.2001.

［5］陈威，钟国才，王亚军等.基于酶抑制的有机磷农药残留快速检测方法进展［J］.广东农业科学，2011，(23):153-154.

［6］王惠，吴文君，潘灿平等.农药分析与残留分析［M］.北京:化学工业出版社，2007.

［7］杜美红，孙永军，汪雨等.酶抑制—比色法在农药残留快速检测中的研究进展［J］.食品科学，2010，31(17):462-466.

［8］赵华.分光光度法快速检测有机磷农药残留的研究［D］.北京:北京工业大学，2006.

［9］陈伟国，孙海燕，郁志华.不同剂型辛硫磷对家蚕的毒性比较［J］.广西蚕业，2013，50(1):33-36.

［10］陈伟国，孙海燕，钱银川等.农药灭多威不同剂型产品对家蚕的毒性评价［J］.蚕业科学，2011，37(3):0574-0578.