MUC1表达与食管癌细胞对紫杉醇及顺铂反应的关系

郑敏 叶清 杨成广 徐烨 郭明 徐志飞

(1.第二军医大学附属长征医院胸外科，上海 200061; 2.上海市长宁区中心医院胸外科，上海 200336；3.上海交通大学医学院附属仁济医院胸外科，上海 201210)

MUC1黏蛋白(简称MUC1)是由MUC1基因编码的一种高糖基化的高分子量蛋白。MUC1对正常上皮有润滑和保护作用，还可介导信号转导和细胞黏附等。研究[1]表明，MUC1在食管癌、胃肠癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中均有不同程度的异常表达，且与患者的预后有相关性。本研究以裸鼠为实验对象，以研究MUC1与食管癌对紫杉醇和顺铂药物敏感性的关系，为临床个体化用药提供参考。

1 资料与方法

1.1 材料与试剂 MUC1过表达的食管癌细胞株(c-7细胞)及MUC1稳定沉默的食管癌细胞株(4-9细胞)由上海交通大学医学院细胞分化与凋亡实验室提供；4周龄BALB/c雌性裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司；顺铂注射液购自江苏豪森制药有限公司，紫杉醇注射液购自中美上海施贵宝药业有限公司；羊抗鼠Ki-67一抗及羊抗鼠Bcl-2一抗购自美国Santa Cruz公司，兔抗羊二抗购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 细胞培养 将冻存的c-7细胞和4-9细胞进行快速复苏，放入37℃、CO2体积分数为5％的培养箱中培养。细胞经多次传代之后，收集足量细胞，调整细胞浓度至1×107/mL，使活细胞比率>90％。

1.3 裸鼠移植瘤实验 购买的裸鼠于SPF级动物房喂养1周以上，将收集的细胞悬液轻轻吹打均匀，取0.2 mL细胞悬液(约2×106/个细胞)，接种于裸鼠的左腋皮下，形成单一皮丘，避免渗漏。接种1周后，肿瘤生长至黄豆大小。

1.4 药物实验 挑选成瘤大小较均一的裸鼠，分为对照组(n=24,接种4-9细胞，MUC1稳定沉默)和实验组(n=24，接种c-7细胞，MUC1过表达)；对照组和实验组均再分为3个处理组(每个处理组各8只)，分别给予0.9％氯化钠液(空载)、顺铂、紫杉醇处理。接种食管癌细胞后第10天起每只裸鼠经腹腔注射给药，顺铂按8 μg/kg的剂量于开始药物试验的第1天及第7天腹腔注射；紫杉醇按20 μg/kg的剂量于开始药物试验的第1天及第7天腹腔注射。

1.5 观察指标

1.5.1 肿瘤体积抑瘤率及体积曲线 于给药后的第1天开始，每3 d用游标卡尺测量肿瘤的长短径，肿瘤的体积(V)按以下公式计算：V = A×B2/2(A，肿瘤长径；B，肿瘤短径)。给药后的第26天处死裸鼠。肿瘤体积抑瘤率的计算∶抑瘤率=(对照组-实验组)/对照组×100％；绘制肿瘤体积曲线。

1.5.2 化疗药物对体质量的影响及体质量曲线 于给药后的第1天开始，每3 d用电子天平测量裸鼠体质量，绘制体质量曲线。

1.5.3 化疗药物对移植瘤增殖调控因子Ki-67及凋亡调控因子Bcl-2表达的影响 给药后的第26天将裸鼠处死，取移植瘤组织，用10％多聚甲醛固定后进行石蜡包埋、切片。采用免疫组化SP法检测MUC1过表达的食管癌细胞形成的移植瘤经化疗药物干预后Ki-67及Bcl-2的表达情况。显微镜下观察、拍摄。

2 结 果

2.1 化疗药物对肿瘤体积的影响及体积曲线 在药物试验的第26天将裸鼠处死。根据时间点(肿瘤细胞种植后天数)绘制MUC1过表达及稳定沉默的食管癌细胞株在裸鼠成瘤的肿瘤体积曲线(见图1A、1B)。4-9细胞注射成瘤的裸鼠中，与空载组相比，紫杉醇组及顺铂组均未见明显的肿瘤体积抑制效应。c-7细胞注射成瘤的裸鼠中，紫杉醇对肿瘤体积抑瘤率为23.1％，顺铂对肿瘤体积抑瘤率为32.8％。

MUC1过表达即c-7细胞注射成瘤的裸鼠中，给予不同化疗药物作用后，空载组和顺铂组在瘤细胞种植后的第20天肿瘤体积的差异有统计学意义(P<0.05)；空载组和紫杉醇组在瘤细胞种植后的第32天肿瘤体积的差异有统计学意义(P<0.05)；而紫杉醇和顺铂组肿瘤体积的差异无统计学意义。MUC1稳定沉默即4-9细胞注射成瘤的裸鼠中，各组间肿瘤体积(两两比较)的差异无统计学意义(P>0.05)。

考虑到不同组别之间或各组别之内体质量差异对肿瘤体积的影响，将测得的肿瘤体积用对应的裸鼠体质量进行校正后再进行瘤体体积曲线分析，得到肿瘤体积/裸鼠体质量曲线图形(见图1C、1D)，组间及组内走势和分析结果与未校正前基本一致。

2.2 化疗药物对体质量的影响及体质量曲线 给药后的第26天将裸鼠处死。根据时间点(瘤细胞种植后天数)绘制MUC1过表达及稳定沉默的食管癌细胞株注射后的裸鼠体质量曲线(见图2)。在4-9细胞注射成瘤的裸鼠中，紫杉醇可以使裸鼠体质量稍增加，紫杉醇组裸鼠在观察时间中期体质量较空载组减少，后期体质量增加明显。在c-7细胞注射成瘤的裸鼠中，紫杉醇及顺铂都可以使裸鼠体质量减少，紫杉醇对裸鼠体质量影响小于顺铂。

在c-7细胞注射成瘤的裸鼠中空载组和顺铂组第20～29天时的裸鼠体质量差异有统计学意义(P<0.05)，紫杉醇组和顺铂组第20～29天时的裸鼠体质量差异均有统计学意义(P<0.05)。在4-9细胞注射成瘤的裸鼠中，仅紫杉醇组和顺铂组在第23～26天时的体质量差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 不同化疗药物对MUC1过表达/稳定沉默种植瘤体积及肿瘤体积/裸鼠体质量比率的影响

图2 不同化疗药物对MUC1过表达/稳定沉默种植瘤裸鼠体质量的影响

2.3 增殖调控因子Ki-67及凋亡调控因子Bcl-2的表达变化 见图3～4。C-7细胞注射成瘤的裸鼠中，Ki-67组织染色显示，与空载组[阳性染色面积占总面积(7.69±0.82)％]相比，紫杉醇组与顺铂组Ki-67呈下调趋势[阳性染色面积占总面积分别为(3.45±0.97)％、(3.01±0.19)％]，差异有统计学意义(P<0.01)。Bcl-2组织染色显示，与空载组[阳性染色面积占总面积(2.37±0.65)％]相比，紫杉醇组与顺铂组Bcl-2呈上调趋势[阳性染色面积占总面积分别为(4.01±0.3)％、(4.41±0.49)％]，差异有统计学意义(P<0.01)。

A,空载组；B，紫杉醇组；C,顺铂组

A,空载组；B，紫杉醇组；C,顺铂组

3 讨 论

研究[2]表明，MUC1的mRNA或蛋白表达升高或异常常提示肿瘤侵袭转移，且与患者的预后相关。

顺铂为治疗多种实体瘤的一线药，是广谱抗肿瘤药物。Chou等[3]发现，顺铂可以诱导子宫颈癌细胞的凋亡，其机制与下调Bcl-2、上调Fas有关。研究[4]还发现，顺铂可以引起食管癌细胞的凋亡，其机制与Bax表达上调相关。本研究发现，顺铂对MUC1过表达的食管癌细胞的生长有一定程度的抑制效应，并可促使肿瘤坏死，说明顺铂可作为MUC1过表达的食管癌的治疗药物，但顺铂对裸鼠体质量的影响较大。

紫杉醇是新型抗微管药物，其诱导细胞凋亡的机制目前尚不完全清楚，抗凋亡蛋白bcl-2的磷酸化可能起关键作用[5]；也有研究[6]提示，紫杉醇通过非依赖p53途径上调P21的表达而促进细胞凋亡；故紫杉醇诱导凋亡的机制尚待进一步研究。本研究显示，紫杉醇对MUC1过表达的食管癌细胞的生长有一定程度的抑制效应，并可促进肿瘤坏死，故可作为MUC1过表达的食管癌的治疗药物；紫杉醇与顺铂对MUC1过表达的食管癌的生长抑制效果无明显差异，但紫杉醇对裸鼠体质量的影响小于顺铂。

本研究确认，免疫组化结果与肿瘤体积测量结果一致。免疫组化染色显示，MUC1过表达的食管癌裸鼠形成的肿瘤经顺铂或紫杉醇处理后，肿瘤增殖调控因子Ki-67呈下调趋势，提示这两种药物可以通过下调Ki-67而影响肿瘤细胞增殖，由此抑制肿瘤生长。

综上所述，紫杉醇和顺铂对MUC1过表达的食管癌细胞生长的抑制效果无明显差异，两者都可用于治疗MUC1过表达的食管癌。

[1]王立顺，朱迅.MUC1和MUC2 mRNA在不同肿瘤组织的表达及其意义[J].中国肿瘤临床， 2000,27(4):258-261.

[2]Creaney J,Segal A,Sterrett G,et al.Overexpression and altered glycosylation of MUCl in malignant mesothelioma [J]．Br J Cancer,2008,98(9): 1562-1569.

[3]Chou TC.Theoretical basis,experimental design,and computerized simulation of synergism and antagonism in drug combination studies [J].Pharmacol Rev,2006,58(3): 621-681.

[4]苏翔宇,李苏宜,刘琳.奈达铂联合顺铂对人食管癌细胞株(Eca-109)抑制作用机制的研究[J].实用肿瘤杂志， 2010,25(2): 150-155.

[5]Pathann,Aime-sempe C,Kitadass,et al.Microtubule-targeting drugs induce bel-2 phosphorylation and association with pin1 [J].Neoplasia,2001,3(6):550-559.

[6]Forster K,obermeier A,Mitina O,et al.Role of p21(WAF1/CIP1)as an attenuator of both proliferative and drug-induced apoptotic signals in BCR-ABL- transformed hematopoietic cells[J].Ann Hematol,2008,87(3):183-193.