木犀草素对人乳腺癌细胞胰岛素样生长因子-1的影响

刘雪飞

(白城医学高等专科学校，吉林 白城 137000)

乳腺癌是发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤，是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年提高。研究发现，细胞因子介导的信号转导发生异常时，将导致细胞快速增殖、无限生长，最终形成肿瘤。胰岛素样生长因子(IGFs)在乳腺腺体发育和乳腺癌发生发展中起重要作用。IGF-1可通过自分泌和旁分泌的方式参与正常乳腺上皮细胞、良性和恶性乳腺肿瘤细胞的促分裂、抗凋亡效应，在乳腺病的形成过程中起重要作用〔1～4〕。木犀草素是从多种蔬菜、水果中分离出的一种天然黄酮类化合物。目前，体内外实验验证了木犀草素的抗肿瘤活性，其抗癌谱较广，毒性很低，是较为理想的抗肿瘤药物。本文旨在探讨木犀草素应用于乳腺癌临床治疗的可行性。

1 材料与方法

1.1材料和试剂 木犀草素购自中国药品生物制品检定所，纯度≥98%。MCF-7 细胞株购自中国医学科学院基础研究所细胞中心。小牛血清和RPMI1640培养基均购自GIBCO 公司，胰蛋白酶购自PAA公司。Trizol购自Invintrigen公司，反转录试剂盒、SYBR Green试剂和DNA Marker均购自Taraka公司。IGF-1引物及内参照β-actin由北京华大基因有限公司合成。IGF-1酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自Sigma公司。

1.2引物设计 IGF-1正义序列为：5′-ATGAGTTCTGACACGGCGG-3′，反义序列为：5′-GTCGACCTAGGCACGGACGG-3′，扩增目的片段长度为210 bp。内参照物：β-actin正义：5′-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3′，反义：5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′，扩增目的片段长度为202 bp。

1.3方法

1.3.1总RNA的提取 取生长状态良好的对数期MCF-7细胞进行细胞传代，先弃培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，然后加入适量的0.25%胰蛋白酶消化，消化后弃去胰酶，补加适量培养基，制备单细胞悬液。调整细胞浓度为2×104个/ml，以每孔4 000个细胞接种于96孔板，培养24 h，待细胞贴壁后，加入终浓度分别为0、20、40、60、80、100 μmol/L的木犀草素溶液与细胞共同孵育24、48、72 h。弃去培养液，PBS洗2次，Trizol法提取细胞RNA，提取的RNA在-80℃冰箱内冻存备用。

1.3.2荧光定量PCR法检测IGF-1的表达 根据 TaqMan®PrimeScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ说明书，以提取的 RNA 为模板，将其反转录为cDNA。全过程在冰上进行操作。反应条件：37℃ 15 min；85℃ 5 s使反转录酶失活，5 s 后降温至4℃。以不同反转录产物cDNA为模板，进行荧光定量检测。荧光定量 PCR 反应体系为20 μl，SYBR®Premix Ex TaqTM10 μl，Rox 0.4 μl，引物2.0 μl，模板1.0 μl，水6.6 μl。反应条件为95℃，30 s 95℃，5 s 55℃，33 s 40个循环；95℃ 15 s，55℃ 60 s，95℃ 15s。荧光定量PCR结果采用△△CT 法进行分析，相对定量结果按 2-△△CT进行计算。

1.3.3ELISA法检测IGF-1的分泌 取对数生长期的MCF-7细胞，以2×104个/孔接种于24孔板，培养24 h。无血清培养基饥饿培养24 h后，加入含0、10、20、40 μmol/L木犀草素的无血清培养液，继续培养6、12、24 h后，收集上清液，按照 IGF-1ELISA试剂盒操作要求，依次进行加样、孵育、洗涤，用酶标仪于450 nm波长下测定上清液的光吸收值。用Curve Exert 1.3软件绘制标准曲线，计算IGF-1含量。IGF-1的检测灵敏度为1.0 ng/ml。

1.4统计学处理 采用 SPSS16.0软件进行分析。多样本均数比较用单因素方差分析，两样本均数比较用t检验。

2 结 果

2.1木犀草素对MCF-7细胞中IGF-1 mRNA水平变化的影响 MCF-7 细胞表达IGF-1。木犀草素能够影响 MCF-7 细胞IGF-1的表达水平，且呈时间和剂量依赖关系。即随着木犀草素浓度的增加，作用时间的延长，IGF-1的相对表达量显著降低(P<0.01)。见图1。

图1 IGF-1 mRNA 在木犀草素作用不同时间后MCF-7细胞中的相对表达量

2.2木犀草素对MCF-7细胞中IGF-1含量的影响 MCF-7 细胞可向细胞培养基中分泌IGF-1。木犀草素能够影响 MCF-7 细胞分泌 IGF-1，且呈时间和剂量依赖关系。40 μmol/L木犀草素作用于细胞24 h后，与对照组相比，IGF-1含量显著降低35.6%(P<0.05)。见表1。

表1 木犀草素对不同培养时间MCF-7细胞中IGF-1含量的影响±s,ng/ml)

3 讨 论

目前，分子靶向药物是用于乳腺癌治疗的研究热点之一。由于化学药物治疗法和放射治疗法对于患者存在很大的危险性，各国学者正在寻找抗肿瘤效果好、安全性高、副作用小的天然的抗乳腺癌药物。黄酮类药物以其种类多、安全性强、抗肿瘤谱广泛、抗肿瘤细胞增殖作用效果明显、毒副作用小、不易产生耐药性等特点，成为国内外筛选抗肿瘤药物的重要资源之一。木犀草素是从天然药物、蔬菜果实中分离得到的一种有较强抗肿瘤活性的天然黄酮类化合物，具有广谱抗肿瘤活性。

木犀草素分布广泛于自然界中，可从金银花、菊花等多种天然药物和芹菜、甜椒等蔬菜果实中分离得到。化学名为3′，4′，5，7-四羟基黄酮，化学式为C15H10O6。近年来的研究发现，木犀草素能抑制多种肿瘤细胞的增殖作用。Chang等〔5〕发现低剂量的木犀草素可抑制5种肝癌细胞系PLC/PRF/5、Hep 3B和HA22T/VGH细胞的增殖，但需较高的浓度木犀草素才能抑制HepG2 和SK-Hep 1的增殖作用。Wu等〔6〕研究发现，木犀草素还可以剂量时间依赖的方式抑制胃癌细胞的生长，并可将细胞周期阻滞在G2/M期，上调caspase-3，6，9，Bax，p53蛋白的表达，下调bcl-2的表达，来抑制胃癌细胞的增殖作用。木犀草素还能诱导肿瘤细胞凋亡。Brusselmans等〔7〕指出，木犀草素可以抑制乳腺癌和前列腺癌细胞的脂肪酸合成酶活性，从而发挥其抗肿瘤细胞增长和诱导其凋亡的作用。还有研究显示，用木犀草素处理人肺癌A549细胞，流式细胞仪分析可显示出Sub-G1期峰值， PCR分析检测出caspase-3基因表达降低，WB检测出caspase-3蛋白表达降低，说明木犀草素可诱导A549细胞发生凋亡〔8〕。同时，木犀草素还可作为肿瘤细胞凋亡增敏剂，Du等〔9〕研究表明，木犀草素可抑制乳腺癌细胞的生长，并可增敏阿霉素对乳腺癌细胞的凋亡诱导作用。另外，木犀草素还能影响肿瘤细胞周期分布。Kim等〔10〕研究发现，木犀草素可以显著抑制血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)诱导的血管平滑肌细胞的增殖作用，并可将细胞周期阻滞于G1期。此外，木犀草素可封闭血管内皮细胞黏附分子的黏附，以限制肿瘤的生长和转移；还可抑制肿瘤血管内皮细胞的生长，以减少肿瘤组织血管生成，从而限制肿瘤生长〔11〕。

IGF-1 是一种重要的多功能细胞因子，与胰岛素高度同源，具有快速代谢效应和促分裂效应〔12〕。在机体内当 IGF-1与 IGF-IR 形成配体受体复合物时，引起受体聚集、自磷酸化和酪氨酸激酶的活化等一系列变化，激活PI3K/Akt和 Ras-MAPK两条信号通路〔13～15〕，产生促进细胞增殖﹑存活及抗细胞凋亡的作用。有文献报道，乳腺癌患者患病组织IGF-1呈高表达状态。研究发现，IGF-1 能诱导乳腺上皮细胞中血管生成因子的大量表达，促进肿瘤组织的血管生成，从而诱导乳腺癌的发生与转化〔16〕。同时参与肿瘤细胞周期调节等效应，在乳腺癌的发生发展中发挥着重要的作用。本研究结果显示，在乳腺癌 MCF-7细胞中添加木犀草素，能显著抑制IGF-1基因的表达，并随着木犀草素浓度的增加，IGF-1相对表达量逐渐降低。木犀草素可以抑制IGF-1基因的表达，实现对IGF-1介导的信号通路进行干扰，进而发挥其抗肿瘤的作用。在对培养的MCF-7细胞上清液中进行IGF-1含量检测时发现，在乳腺癌 MCF-7细胞中添加木犀草素，能显著抑制上清液中IGF-1的分泌，并随着木犀草素浓度的增加，IGF-1分泌量逐渐降低。这与木犀草素对IGF-1基因表达的影响相一致。这表明，木犀草素对MCF-7细胞IGF-1的影响在基因水平和蛋白水平都能实现。木犀草素通过抑制IGF-1基因表达及其分泌，实现对IGF-1介导的信号转导通路进行干扰，进而发挥其抗肿瘤的作用。

综上，乳腺癌的发生发展是一个复杂过程，抗肿瘤药物的作用靶点也多种多样，明确木犀草素对乳腺癌发生发展中关键细胞因子的影响，对分析木犀草素的详细抗肿瘤通路奠定实验基础，也将为今后的抗肿瘤安全特效药的开发提供理论依据。

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