miR-20a对前列腺癌细胞的侵袭及其机制

张政伟 强晓菲 付建华 郭 利 王志勇

(承德医学院，河北 承德 067000)

前列腺癌是中老年男性生殖系统最常见的恶性肿瘤，也是男性癌死亡的主要病因之一〔1〕。由于早期症状不明显，诊断时患者岁数一般较大，并且容易发生转移，导致预后不良。因此探讨前列腺癌发生和转移的分子机制为提高诊断和预后至关重要。微小RNA(microRNA或miRNA)是一类内源性的，非编码单链RNA分子，在转录后水平调控基因的表达〔2,3〕。miRNA在多种生物学过程中发挥着作用〔4,5〕。研究表明miRNA的表达异常与肿瘤的发生、发展关系密切〔6〕，在肿瘤中扮演着肿瘤抑制基因或者癌基因的角色〔7〕。本研究检测miR-20a在前列腺癌组织和细胞中的表达水平，探讨miR-20a对前列腺癌细胞生长和侵袭的影响，并寻找miR-20a的靶基因来阐述其发挥作用的机制。

1 材料和方法

1.1材料和试剂 30对前列腺癌和正常组织来源于河北承德医学院附属医院泌尿外科。样本得到病人的同意并通过病理学和免疫组化方法加以验证。miR-20a ASO和对照寡核苷酸以及含有ABL2 3'UTR的荧光报告载体均购自上海吉玛生物技术公司，转染试剂LipofectamineTM 2000购自Invitrogen公司，组织和细胞miRNA提取试剂盒购自Qiagen公司，反转录酶购自Fermentas公司，实时定量PCR的SYBR Green Mix购自Takara公司。体外细胞侵袭的Transwell小室购自Millipore公司。兔抗人ABL2抗体和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体以及羊抗兔的二抗均购自武汉三鹰公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养和转染 本实验涉及的所有细胞均用含有10%血清的培养液在5%CO2、37℃孵箱中培养。正常前列腺上皮细胞(RWPE-1)的培养基是角细胞无血清培养液(K-SFM)，并含有0.05 mg/ml BPE和5 ng/ml 表皮生长因子(EGF) 。前列腺癌细胞DU145、PC-3和LNCaP的培养基是RPMI 1640，而VCaP的培养基是DMEM。细胞在转染前接种到6孔板或者48孔板，待第2天细胞密度达到80%时利用LipofectamineTM 2000进行转染。

1.2.2RNA提取和实时定量PCR 组织和细胞中miRNA的提取根据miRNA提取试剂盒的说明进行。提取的RNA利用NanoDrop ND-1000进行浓度和质量的测定。取500 ng RNA进行反转录反应，对于miRNA的反转录反应，利用miR-20a的特异性反转录引物。得到的cDNA产物稀释5倍后取2 μl进行PCR反应，反应体系是：cDNA 2 μl，上下游引物各1 μl，2×SYBR Green Mix 10 μl，无菌蒸馏水6 μl。在ABI 7 300实时定量PCR仪上进行。反应条件是：95℃ 30 s，随后进行95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s 40个循环。本实验以U6 RNA作为内参检测组织和细胞中miR-20a的表达水平。

1.2.3细胞克隆形成实验 将转染后的前列腺癌细胞以200个细胞/孔的密度接种到12孔板，细胞培养液每隔3 d换1次，大概10 d，大部分细胞克隆含有超过50个细胞时，倒掉培养液用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞后，利用5%结晶紫进行克隆染色，染色后在显微镜下拍照并进行计数。

1.2.4体外细胞侵袭实验 将转染的细胞消化后重悬在无血清培基中，接种到含有Matrigel的Transwell小室内(2.5×104细胞)，小室外是含有10%血清的培养基。待细胞侵袭20 h，取出小室，用PBS清洗、4%甲醛固定、甲醇穿透后，将未穿过小室膜的细胞用棉签擦去，穿过膜的细胞用5%结晶紫染色，最后在显微镜下拍照，随机选择细胞分布相对均匀的视野，计数平均每个视野下穿透的细胞数。

1.2.5Western 印迹实验 细胞转染48 h后，PBS清洗细胞，利用RIPA裂解液提取细胞的蛋白。用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白质的浓度。取15 μg蛋白进行十二烷基本硫酸钠-聚丙烯酸胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，之后转膜、封闭，用兔抗人的ABL2抗体室温孵育2 h，Tis盐酸缓冲液(TBST)洗膜，二抗用带有辣根过氧化物酶的羊抗兔抗体室温孵育1 h后增强化学发光法(ECL)显影，并分析条带的强度。本实验利用GAPDH作为内参检测ABL2的表达水平。

1.2.6生物信息学预测 本实验中，靶基因预测遵循以下原则：(1)靶基因预测软件TargetScan、miRanda和microRNA.org预测的靶基因3'UTR含有miR-20a的结合位点；(2)候选靶基因的功能与miR-20a的作用相关；(3)靶基因在前列腺癌中是表达的。

1.2.7绿色荧光蛋白(GFP)荧光报告载体实验 细胞同时转染miR-20a的ASO和含有ABL2 3'UTR的报告载体以及ASO的对照和ABL2 3'UTR的报告载体。转染48 h后，PBS清洗细胞，利用RIPA裂解液提取细胞的蛋白。利用荧光测定仪器测定GFP的荧光强度。本实验中，细胞转染的同时转染表达红色荧光红色荧光蛋白(RFP)的质粒作为内参。

2 结 果

2.1实时荧光定量PCR检测前列腺癌组织和细胞中miR-20a的表达 与正常组织相比，24例前列腺癌中miR-20a的表达水平升高。利用实时定量PCR检测正常前列腺上皮细胞RWPE-1和前列腺癌细胞中miR-20a的水平，结果显示miR-20a在前列腺癌细胞中表达明显升高(RWPE-1、LNCaP、PC-3、DU145、VCaP细胞miR-20a mRNA表达量分别为1.0、2.41、5.83、7.92、3.16，均P<0.05)。

2.2miR-20a对前列腺癌细胞增殖和侵袭的影响 ASO组细胞内miR-20a的表达水平较对照组降低约80%(PC细胞：0.14 vs 1.0；DU 125细胞：0.21 vs 1.0)(P<0.05)。克隆形成实验结果显示，转染miR-20a ASO组的PC-3(86.48 vs 97.26)和DU145细胞(79.57 vs 88.93)克隆形成数较对照组降低约15%。Transwell小室实验，miR-20a ASO组细胞穿过膜的细胞数明显低于对照组(PC细胞：25.31 vs 60.24,DU145细胞：47.72 vs 112.38)减少约60%(P<0.05)。见图1。

图1 miR-20a对前列腺癌细胞增殖和侵袭的影响

2.3miR-20a靶定ABL2靶基因 遵循靶基因筛选原则，初步选择ABL2作为miR-20a的候选靶基因，ABL2 3'UTR与miR-20a的结合位点。在细胞中同时转染miR-20a ASO和ABL2 3'UTR，GFP荧光报告载体实验显示，miR-20a ASO组中ABL2 3'UTR的荧光强度(PC-3细胞：1.32， DU125细胞：1.41)较对照组(1.0)增强(P<0.05)。但是，将结合位点内部分碱基进行突变后，miR-20a ASO对突变的ABL2 3'UTR没有影响(GFP荧光强度：PC-3细胞1.08，DU125细胞0.94，对照组为1.0)，说明ABL2是miR-20a的直接靶基因。而且,Western 印迹结果显示，miR-20a ASO组细胞中ABL2的蛋白水平(PC-3、DU145、LNCaP、VCaP细胞分别为3.41、2.13、2.82、1.92)较对照组(1.0)升高，而过表达miR-20a的mimics组细胞中ABL2的表达水平(PC-3、DU145、LNCaP、VCaP细胞分别为0.21、0.32、0.47、0.58)降低(P<0.05)。见图2。

图2 miR-20a靶基因ABL2验证

2.4干扰ABL2表达对前列腺癌细胞侵袭的影响 转染siRNA的细胞中ABL2的水平降低约80%(对照组为1.0，PC-3细胞：0.18，DU145细胞：0.21)(P<0.05)。体外侵袭实验结果显示，与siRNA对照组相比，ABL2 siRNA组的细胞穿过膜的细胞数升高约1.5或者2倍(PC-3细胞：siRNA对照组vs ABL2 siRNA组为61.12 vs 143.67;DU145细胞：siRNA对照组vs ABL2 siRNA组为43.23 vs 106.75)，且差异均具有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 RNA干扰ABL2表达对前列腺癌细胞侵袭的影响

2.5补救实验验证miR-20a通过靶定ABL2调控前列腺癌细胞的侵袭 ABL2 siRNA可以恢复由miR-20a ASO引起的ABL2水平的升高(图4A，4B)；体外侵袭实验结果同样显示，ABL2 siRNA组中细胞穿膜数较对照组升高，说明ABL2 siRNA可以恢复由miR-20a ASO引起的细胞侵袭能力的降低(P<0.05)(见图4C)。

图4 补救实验验证miR-20a通过靶定ABL2调控前列腺癌细胞的侵袭

3 讨 论

miRNA作为基因表达中一类重要的调控因子，与肿瘤的发生发展关系密切。在本研究结果与其他研究中的发现一致，例如，miR-20a可以促进胆囊癌细胞的侵袭和转移〔8〕；miR-20a通过调控Fas基因的表达从而增加骨肉瘤细胞发生转移的能力〔9〕。miR-20a位于13号染色体，是miR-17-92基因簇的成员。该基因簇编码6个miRNA，包括miR-17、miR-18a、miR-19a、 miR-20a、miR-19b和miR-92a〔10〕。该家族成员在大部分肿瘤中表达较高，发挥着癌基因的作用。

本研究中，生物信息学方法预测显示ABL2是miR-20a的潜在靶基因。GFP荧光报告载体实验显示，转染miR-20a ASO的细胞中miR-20a的表达降低后，ABL2 3'UTR的荧光强度增强，而将结合位点部分碱基突变后导致作用消失，同时Western 印迹实验也证实抑制miR-20a表达后，ABL2的蛋白水平降低，证实ABL2是miR-20a的直接靶基因。miR-20a通过作用于ABL2 3'UTR上的结合位点而抑制ABL2的表达水平。

ABL2，即非受体的酪氨酸激酶 Abelson相关基因，位于1号染色体，通过调控细胞骨架参与对细胞形态以及侵袭迁移能力的调控〔11〕。RAS的作用因子RIN1可以通过与ABL蛋白的SH2和SH3结构域结合，从而激活ABL2的催化活性，引起下游细胞骨架调控因子的磷酸化，在细胞黏附、侵袭和迁移过程中发挥着重要的作用〔12〕。这些研究表明ABL2参与对细胞侵袭行为的调控。本研究也得到了类似的结果，ABL2的表达敲降后，细胞的侵袭能力增强，并且可以恢复由miR-20a封闭所引起的细胞侵袭能力的降低，进一步验证ABL2介导miR-20a对细胞侵袭行为的发挥。

综上，miR-20a通过抑制ABL2的表而促进前列腺癌细胞的侵袭，发挥着癌基因的作用。因此，抑制miR-20a的表达有可能为以后前列腺癌的分子治疗奠定理论基础。虽然基因治疗在临床应用上还有很大的障碍，但是癌症发生过程关键分子的发现可以提供更多的依据和策略。

4 参考文献

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