DQA1基因启动子区及编码区与大动脉炎的关联研究

吕纳强 党爱民 郑德裕 刘国仗

临床研究

DQA1基因启动子区及编码区与大动脉炎的关联研究

吕纳强 党爱民 郑德裕 刘国仗

作者单位：100037 北京市，北京协和医学院中国医学科学院阜外心血管病医院特需医疗中心

目的 大动脉炎（Takayasu arteritis）是一种累及主动脉及其主要分支的慢性进行性非特异血管炎性疾病。本研究以人类白细胞抗原（HLA）-DQA1为候选基因分析其编码区基因型和启动子区多态性与中国大动脉炎的关联。方法 采用病例对照研究的方法，入选中国汉族大动脉炎患者100例和健康对照104例，应用聚合酶链反应-序列特异性引物（PCR-SSP）和聚合酶链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP）方法检测HLA-DQA1基因编码区和启动子区基因型，并分析基因型与疾病的关联。结果 具有类似DQα链蛋白抗原结合槽部位肽结合袋的氨基酸组成结构的DQA1*0301/2/3基因型，在大动脉炎组显著低于对照组（P=0.003）。DQA1启动子QAP 1.3在大动脉炎组低于对照组（P=0.036）。结论 DQA1*0301/2/3基因型、DQA1启动子QAP 1.3基因型可能是大动脉炎的保护基因型。

大动脉炎； DQA1等位基因； HLA基因

大动脉炎（Takayasu arteritis）是累及主动脉及其主要分支的慢性进行性非特性血管炎性疾病。炎症损害中层动脉壁，致大动脉狭窄、扩张或动脉瘤形成[1-3]。大动脉炎在我国并不罕见，1962年阜外医院在国际上首先提出缩窄性大动脉炎的概念，此后发现了大量的临床病例[4,5]。大动脉炎的病因及发病机制尚不清楚，目前认为大动脉炎发病与人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）基因密切相关[6]。

在大动脉炎与HLA基因的关联研究中，不同种族人群报道的易感基因型不同。日本的Dong等[7]对64例日本患者的研究发现，DQA1*0103在患者中频率显著升高，DQA1*0301在患者中频率显著低于正常对照。Khraishi等在北美的人群中未发现易感基因。Girona等在墨西哥患者中发现易感基因型是DRB1*1301。中国大动脉炎患者与HLA-Ⅱ类基因相关性结果最早见于2000年党爱民等[8]对84例患者的研究，发现DRB1*04、DRB1*07与大动脉炎易感相关。此后肖占祥等对44例患者研究后发现DQA1*0301频率显著低于正常对照。从上述研究结果可知，对于HLA-Ⅱ类基因，在不同人群中的结论差异较大，可能与种族的差异有关，也可能部分研究例数较少，难以揭示易感基因型。此外，基因启动子的变异可能也参与疾病的发生、发展。基于上述研究结果，同时为进一步揭示大动脉炎发病与HLA-DQA1类基因的关联，本研究扩大样本量分析了中国汉族HLA-DQA1基因编码区与大动脉炎的关联，并首次筛查了大动脉炎患者DQA1启动子区的多态性及与疾病的关联，以期探索大动脉炎的遗传易感基因型。

1 对象与方法

1.1 研究对象 本研究采用病例对照设计，入选汉族大动脉炎患者100例，无血缘关系。大动脉炎患者来自于阜外心血管病医院。大动脉炎诊断采用1990年美国风湿协会标准。健康对照组入选104例。对照组入选标准：无高血压、自身免疫性疾病、糖尿病、遗传性结缔组织疾病、自身免疫性疾病家族史的健康体检者。入选者均签署知情同意书。本研究得到阜外心血管病医院伦理委员会批准。

1.2 HLA-DQA1基因编码区PCR-SSP法分型 抽取入选患者及对照组人群静脉血4 ml，用EDTANa2抗凝保存，采用饱和氯化钠氯仿法提取外周血基因组DNA。根据Olerup等[9]设计11对SSP引物采用聚合酶链反应-序列特异性引物（polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP） 进行HLA-DQA1基因分型，根据HLA-DQA1基因外显子3的217位SNP C/A设计PCR-SSP引物将DQA1*0301和DQA1*0302/3进行区分。

1.3 HLA-DQA1基因启动子区PCR-SSCP法分型采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析（polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism，PCR-SSCP）方法对 HLA-DQA1基因启动子区进行筛查及分型，纯合子SSCP带型为1条或2条，杂合子带型为3条或4条。以纯合子SSCP带型为基础与杂合子比对，测序验证。从NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）网站上的 dMHC 数据库中查找不同HLA-DQ基因的等位基因序列及相对应的特异性氨基酸序列。与文献序列比对后，8种带型的QAP等位基因根据相似的序列依次分别命名为 QAP4.1、QAP1.4、QAP2.1、QAP3.12、QAP4.2、QAP1.2、QAP1.3 和 QAP3.11。

1.4 统计学方法 应用SPSS 16.0软件包分析数据。计量数据用±s进行统计描述，2×2表卡方检验或Fisher精确概率法分析组间等位基因频率、基因型频率和单倍型频率，计算P值、OR值及95%CI。多元Logistic回归分析调整混杂因素的影响。采用双侧统计学显著性检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 入选大动脉炎患者临床资料 入选大动脉炎患者100例，其中男性26例，女性74例，男女比例为 1∶2.85，平均年龄（33.08±12.17）岁。对照组均为汉族，其中男性30名，女性74名，男女比例为1∶2.47，平均年龄（34.82±9.67）岁。入选大动脉炎组患者与健康对照组两组间性别、年龄比较差异无统计学意义。

2.2 HLA-DQA1编码区等位基因频率分布分析在HLA-DQA1编码区等位基因DQA1*0302/3的频率大动脉炎组显著低于对照组（12.50%比20.19%，P=0.036，OR=0.565，95%CI 0.330～0.968），余等位基因大动脉炎组与对照组未见明显差异。见表1。

2.3 HLA-DQA1启动子区等位基因频率分析 在HLA-DQA1启动子区，QAP1.3在大动脉炎组显著低于对照组 （5.00%比 10.58%，P=0.036，OR=0.445，95%CI 0.205～0.965），余等位基因大动脉炎组与对照组未见明显差异。见表2。

2.4 大动脉炎患者发病与HLA-DQA1基因Logistic回归分析 调整年龄、性别，对HLA-DQA1基因型与大动脉炎发病进行Logistic逐步回归分析，结果显示，具有类似DQα链蛋白抗原结合槽部位肽结合袋的氨基酸组成结构的DQA1*0301/2/3基因型，大动脉炎组显著低于对照组（P=0.003）。

3 讨论

大动脉炎是累及大动脉的炎症性疾病，多见于主动脉弓及其主要分支，亦可累及肺动脉、冠状动脉，受累的血管表现为全层动脉炎。其病因迄今尚不明确，一般认为是自身免疫因素和遗传背景共同参与导致的自身免疫性疾病[1-3,6，10]。

表1 HLA-DQA1编码区等位基因频率分布［例数及百分率（%）］

表2 HLA-DQA1启动子区等位基因频率分布［例数及百分率（%）］

HLA-DQA1分子是由HLA-DQA1基因编码的α链和β链互补形成的异二聚体，基因的多态性主要体现于胞外区结构域α1和β1形成的抗原结合槽部位。HLA-DQA1等位基因编码的DQα链蛋白，它递呈外来抗原给CD4+T细胞，不同等位基因编码结构不同，从而影响结合抗原肽的种类和亲和力，使免疫应答的效率不同。NCBI网站DQA1编码区10个等位基因编码的氨基酸序列比对结果显示，全长246个氨基酸的DQα链蛋白中41个氨基酸存在显著差异，HLA-DQA1基因外显子多态性决定了抗原结合槽部位肽结合袋的多样性。

在既往的研究中，Dong等[7]对64例日本患者的研究发现，DQA1*0103在患者中频率显著升高，DQA1*0301在患者中频率显著低于正常对照。国内肖占祥等对44例汉族患者研究后也发现，DQA1*0301频率显著低于正常对照。本研究共入选了100例大动脉炎患者，研究结果未发现与大动脉炎发病关联的HLA-DQA1易感基因；DQA1*0301等位基因型频率在大动脉炎组低于对照组（7.0%比10.1%），差异无统计学意义；而DQA1*0302/3在大动脉炎组显著低于对照组（12.50%比20.19%，P=0.036，OR=0.565，95%CI 0.330～0.968）。 通 过 对DQα链蛋白抗原结合槽部位肽结合袋的氨基酸组成分析，在HLA-DQA1最具多态性的第二外显子的主要抗原结合槽，DQA1*0301与DQA1*0302/3具有相同的氨基酸组成，推测这一结构可能减少大动脉炎的发病。将DQA1*0301、DQA1*0302/3二者合并采用Logistic逐步回归模型分析，大动脉炎组频率显著低于对照组（P=0.003），Bonferroni校正后差异仍有统计学意义，结果进一步支持了上述推测。

基因启动子区的多态性影响表达效率。本研究首次筛查了大动脉炎患者HLA-DQA1启动子区的多态性，发现了至少8种基因型，其中3型包含缺失的变异。体外研究[11]均表明，HLA-DQA1启动子多态性可影响其分子的表达，转录活性QAP 3.11＞QAP 1.1＞QAP 4.2。此外，QAP2.1调控的分子表达水平也显著高于QAP4。本研究未发现与大动脉炎遗传易感相关的多态性；HLA-DQA1启动子区QAP1.3在大动脉炎组低于对照组（5.00%比10.58%，P=0.036，OR=0.445，95%CI 0.205～0.965），HLA基因启动子区多态性在大动脉炎中的作用尚需进一步研究探讨。

本研究通过检测中国汉族大动脉炎患者HLADQA1基因编码区及筛查DQA1启动子区的多态性，初步结果发现DQA1*0301/2/3基因型、DQA1启动子QAP 1.3基因型是大动脉炎的保护基因型。未来更多的HLA基因与大动脉炎的研究结果将有助于解释HLA基因在大动脉炎发病中的作用。

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The association of polymorphisms in the HLA-DQ gene with Takayasu arteritis

LYU Na-qiang，DANG Ai-min，ZHENG De-yu，et al.Special Medical Treatment Center，Fuwai Hospital，Beijing 100037，China

Objective Takayasu arteritis（TA）is a chronic inflammatory arteritis affecting the aorta and its main branches.In this study a population based case-control study was used to analyze the association of polymorphisms in the HLA-DQA1 gene and DQA1 promoter（QAP）with the development of TA in Chinese Han population.Methods The study selected 100 TA patients and 104 healthy control subjects.Genotyping of polymorphisms in the coding region of HLA-DQA1 gene were performed with polymerase chain reaction-sequence specific primer（PCR-SSP）.Polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism（PCR-SSCP） was used to screen the mutations in the promoter region of HLA-DQA1 gene.Results The frequency of DQA1*0301/2/3 allele in TA patients was significantly lower than that in control subjects（P=0.003）.The frequency of QAP 1.3 in TA patients was significantly lower than that in control subjects（P=0.036）.Conclusion The alleles of DQA1*0301/2/3，QAP1.3 are the resistant factors to TA.

Takayasu arteritis； DQA1 allele； HLA gene

DANG Ai-min，E-mail：gemmadang@163.com

国家自然科学基金（项目编号：30370568）

党爱民，E-mail：gemmadang@163.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2014.08.001

R543.1

A

1672-5301（2014）08-0673－04

2014-06-22）