高效液相色谱-串联质谱法测定艾瑞昔布片中艾瑞昔布的含量

李飞高，刘西哲，卢彦芳，赵晓娟，张志清*

(1.河北医科大学第二医院药剂科，河北 石家庄 050000；2.河北医科大学第三医院药剂科，河北 石家庄 050051)

·论著·

高效液相色谱-串联质谱法测定艾瑞昔布片中艾瑞昔布的含量

李飞高1，刘西哲2，卢彦芳1，赵晓娟1，张志清1*

(1.河北医科大学第二医院药剂科，河北 石家庄 050000；2.河北医科大学第三医院药剂科，河北 石家庄 050051)

目的建立测定艾瑞昔布片剂中艾瑞昔布的高效液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-mass sepectrometry，LC-MS/MS)含量测定方法。方法样品经甲醇-水(80∶20,V/V)提取，0.22μm微孔滤膜滤过后采用LC-MS/MS法测定其中艾瑞昔布的含量。色谱柱为Waters Symmetry R C18(3.5μm,2.1mm×100mm)，流动相为乙腈-水，梯度洗脱；离子源为电喷雾离子化源(ESI源)，离子源温度为550 ℃，以多反应监测方式分别监测离子对m/z 370.2～278.2(艾瑞昔布)和m/z 346.1～198.0(内标奥美拉唑)。结果艾瑞昔布的监测浓度在31.83～509.34μg/L范围内与内标的峰面积比值呈良好线性关系(r=0.997 6)；平均加样回收率在95.6%～103.4%范围内，相对标准差均小于6.1%(n=9)。结论该方法快速、灵敏，结果准确，适用于艾瑞昔布片剂的质量控制。

色谱法，高压液相；串联质谱法；艾瑞昔布

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.03.001

艾瑞昔布(imrecoxib)为环氧化酶2(cyclooxygehase-2,COX-2)选择性抑制剂，于2011年5月获国家食品药品监督管理局批准上市[1-2]。研究结果[3-7]表明，该药通过抑制COX-2mRNA的表达而发挥其抗炎作用，对于急性和慢性炎症具有潜在的治疗作用，同时具有较高的安全性。艾瑞昔布为新化合物，化学名称为1-正丙基-3-(4-甲基苯基)-4-(4-甲磺酰基苯基)-2,5-二氢-1H-2-吡咯酮。已有文献[8-9]报道使用高效液相色谱-串联质谱(liquidchromatography-masssepectrometry，LC-MS/MS)法测定生物样品中艾瑞昔布及其代谢物的含量，制剂含量测定及质量控制方法则未见报道。本实验首次建立了灵敏、简便、快速的液相色谱-串联质谱法[10]用于该制剂的分析检测和质量控制。

1 仪器与试药

API4000+型液相色谱-三重四级杆质谱联用仪，配有电喷雾离子化源和Analyst1.6.1数据处理系统(ABSCIEX公司)；ProminenceCBM-20A型液相色谱仪，配有二元梯度泵、在线脱气机、自动进样和柱温箱(日本岛津公司)；CPA225D型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；KQ-300B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

艾瑞昔布对照品(江苏恒瑞医药股份有限公司，批号66311003，纯度为99.6%)；奥美拉唑(鲁南制药有限公司，纯度为99.7%)；艾瑞昔布片(江苏恒瑞医药股份有限公司，规格0.1g；批号，11102551、12070351、12100351)；乙腈为色谱纯，水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 试验条件

2.1.1LC条件：色谱柱，WatersSymmetryRC18
(100mm×2.1mm，3.5μm)；柱温，40℃;流动相，乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱(0min，30%A；0～3min，30%→95%A；3～4min，95%A；4min，30%A；4～7min，30%A)；流速0.4mL/min；进样量2μL。

2.1.2MS条件：离子源，电喷雾离子化源(ESI源)；监测方式，正离子监测；离子源喷射电压5 500V；离子源温度550 ℃；气帘气压力10psi；碰撞气压力4psi；扫描方式，多反应监测；用于定量分析的离子反应分别为m/z370.2～278.2 (艾瑞昔布)和m/z346.1～198.0(奥美拉唑)，扫描时间100ms。

2.2 溶液的制备与测定方法

2.2.1 供试品溶液的制备：取艾瑞昔布片20片，精密称定，研细，精密称取适量(0.5g)，置于250mL量瓶中，加水50mL，振摇，加甲醇适量，超声提取15min，放冷至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过。精密量取续滤液0.25mL，置于250mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 对照品溶液的制备：取艾瑞昔布对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释，获得浓度为305.6mg/L的对照品贮备液。取该贮备液适量，加甲醇进行系列稀释，获得浓度为1 019.67、509.34、254.67、127.33、63.67μg/L的一系列标准溶液。

2.2.3 空白溶液的制备：按处方比例称取一定量的不含艾瑞昔布的空白辅料，按照“2.2.1”项下方法制备空白溶液。

2.2.4 测定法：精密量取上述空白溶液、系列标准溶液和供试品溶液各0.5mL，分别精密加入浓度为84.7μg/L的奥美拉唑溶液0.5mL，摇匀。取2μL进样测定，记录艾瑞昔布和奥美拉唑的色谱峰峰面积。

2.3 结果

2.3.1MS条件的选择：取200μg/L的艾瑞昔布标准溶液，以10μL/min的速度注入MS/MS仪，分别在正负离子检测模式下记录艾瑞昔布的一级MS和二级MS图。结果表明，艾瑞昔布具有较强的正离子信号，正离子比较稳定，因此选择正离子模式进行艾瑞昔布的定量检测。分别选定艾瑞昔布和奥美拉唑的监测离子对为m/z370.2～278.2和m/z346.1～198.0。随后进行系统优化，确定了MS检测的最佳参数，包括源喷射电压(5 500V)、源温度(550℃)、气帘气压力(10psi)、碰拦气压力(4psi)、CE(艾瑞昔布31eV，奥美拉唑14eV)、DP(艾瑞昔布120V，奥美拉唑52V)。

2.3.2 干扰试验：取空白溶液、艾瑞昔布标准溶液和供试品溶液各适量，按照“2.2.4”项下方法采用LC-MS/MS法进行分析，记录色谱图。艾瑞昔布和奥美拉唑的保留时间分别为3.92min和2.63min，空白溶液中未见干扰峰，表明共存组分不会影响艾瑞昔布的定量检测。

2.3.3 线性关系考察：取艾瑞昔布系列标准溶液适量，按“2.2.4”项下方法测定，记录色谱图。以艾瑞昔布的检测浓度(X)为横坐标，艾瑞昔布和奥美拉唑的峰面积比值(Y)为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归分析，计算得回归方程为Y=0.002 65X+0.040 8(r=0.997 6，n=5)。结果表明，艾瑞昔布的检测浓度在31.83～509.34mg/L范围内线性关系良好。

2.3.4 检测限(limitofdetection,LOD)和定量限(limitofquantity,LOQ)：取艾瑞昔布对照品溶液稀释若干倍，按照“2.2.4”项下方法进样分析，根据S/N≥3∶1，测得艾瑞昔布的LOD为0.5mg/L；根据S/N≥10∶1，测得艾瑞昔布的LOQ为1.5mg/L。

2.3.5 精密度试验：取浓度为254.67mg/L的对照品贮备液，按照“2.2.4”项下方法进样分析，重复进样6次。结果，RSD=1.4%(n=6)，表明方法精密度良好。

2.3.6 重复性试验：取适量样品6份，分别按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，照上述色谱条件进样测定。结果，RSD=1.2%(n=6)，表明方法重复性良好。

2.3.7 稳定性试验：取同一份供试品溶液适量，分别于0、2、4、6、8、12h依法进样测定。结果，RSD=1.1%(n=6)，表明艾瑞昔布在12h内稳定。

2.3.8 加样回收率试验：取同批样品细粉适量(相当于艾瑞昔布50mg)，共9份，分别置于50mL量瓶中，加入艾瑞昔布对照品适量，配制成低、中、高三个浓度，按照“2.2.3”项下方法操作，测定含量，计算加样回收率，见表1。

表1 回收率试验结果Table 1 Results of recovery tests (n=9)

RSD：relative standard deviation

2.3.9 样品含量测定：取3个批次的艾瑞昔布片，按照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.2.4”项下色谱条件进行含量测定。3批样品的含量测定结果见表2。

表2 样品含量测定结果Table 2 Results of content determination of samples (n=3)

RSD：relative standard deviation

3 讨 论

3.1 流动相的选择：本实验考察了流动相条件，甲醇-水、乙腈-水。发现流动相为甲醇-水时，峰型不好，形成多重峰。无论是改变流动相比例，还是使用等度、梯度洗脱，状况均未改善。流动相改为乙腈-水时，峰型有了较好的改观。本实验又进一步考察了不同组成和不同梯度的流动相对分析结果的影响，使得艾瑞昔布与内标奥美拉唑的保留时间适中。结果表明艾瑞昔布与奥美拉唑可获得良好地分离，未发现干扰成分，并且最终运行时间为7min，方法简便、快速、准确。

3.2 内标的稳定性:奥美拉唑的结构具有亚磺酰基，是弱碱性化合物，在酸性溶液中容易降解，很快分解为砜化物和硫醚化物；同时，奥美拉唑溶液的稳定性受温度和光线的影响，应低温、避光、现配现用。

本实验通过优化色谱和质谱条件建立了LC-MS/MS法测定艾瑞昔布片中艾瑞昔布的含量，经过方法学确证，结果表明本法专属性好、灵敏度高、线性关系良好，适用于艾瑞昔布片剂的质量控制。

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CONTENTDETERMINATIONOFIMRECOXIBINIMRECOXIBTABLETSBYLC-MS/MS

LIFeigao1,LIUXizhe2,LUYanfang1,ZHAOXiaojuan1,ZHANGZhiqing1*

(1.DepartmentofPharmacy,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China;2.DepartmentofPharmacy,theThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050051,China)

ObjectiveToestablishahighperformanceliquidchromatography-masssepectrometry(LC-MS/MS)methodforthedeterminationofimrecoxibinimrecoxibtablets.MethodsThesampleswerefirstlyextractedwithmethanol-watersolution(80∶20,V/V),andthenfilteredthrough0.22μmmicroporefilm.ThecontentofimrecoxibwasdeterminedbyLC-MS/MS.ThedeterminationwasperformedonWatersSymmetryRC18(3.5μm,2.1mm×100mm)columnwithgradientelution.Themassspectrometerwasoperatedinthepositiveionizationelectrospray(ESI)modeusingmultiplereactionmonitoringforanalysisofimrecoxibat550℃.Thetransitionsofm/z370.2-278.2(imrecoxib)andm/z346.1-198.0 (omeprazole)wereusedtoquantifyimrecoxibandomeprazole.ResultsThelinearrangeofimrecoxibwas31.83-509.34μg/L(r=0.997 6)andthemethodrecoverywaswithin95.6%-103.4% (RSD<6.1%,n=9).ConclusionThemethodisrapid,sensitiveandaccurate,anditissuitableforthequalitycontrolofimrecoxibtablets.

chromatography,highpressureliquid;tandemmassspectometry;imrecoxib

2013-05-20；

2013-08-28

李飞高(1985-)，男，河北邢台人，河北医科大学第二医院药师，理学硕士，从事临床药学、药物新制剂研究。

*通讯作者。E-mail：777yyy@sina.cn

R446.1

A

1007-3205(2014)03-0249-03

刘斯静)