过敏性紫癜性肾炎患儿血清IgA1对肾小球系膜细胞增殖及TNF-α分泌的影响

崔雅璠+++杨晓青+++段凤阳++++翟宗岗++刘丽雅

[摘要] 目的 观察过敏性紫癜性肾炎（HSPN）患儿及健康儿童血清IgA1对小鼠肾小球系膜细胞（MES）增殖及TNF-α分泌的影响。 方法 采集2013年5～12月于河南中医学院第一附属医院儿科住院的40例HSPN患儿及20名健康儿童血清；通过Jacalin亲和层析联合Superdex-200分子筛层析的方法将血清中单聚体IgA1（mIgA1）纯化、分离，将mIgA1热聚合为聚合IgA1（aIgA1）；采用不同浓度的患儿及健康儿童的aIgA1分别刺激MES细胞株，用MTT法检测24 h及48 h的细胞增殖情况；收集培养48 h的细胞培养基上清，用ELISA法测定TNF-α的水平。 结果 在HSPN患儿aIgA1刺激结果中，不同浓度aIgA1刺激组间MTT实验吸光度的比较，差异有统计学意义（P < 0.05），24 h MTT实验结果显示：与阴性对照比较，aIgA1刺激浓度在250、1000 μg/mL时，细胞增殖差异均有统计学意义（P < 0.05），在aIgA1浓度为500和750 μg/mL时，细胞增殖差异有高度统计学意义（P < 0.01）；48 h MTT实验结果显示：与阴性对照比较，在aIgA1刺激浓度50 μg/mL时，细胞增殖差异有统计学意义（P < 0.05），在100～1000 μg/mL时，细胞增殖差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。健康儿童在aIgA1刺激浓度在750和1000 μg/mL可刺激MES增殖，与阴性对照比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。HSPN患儿aIgA1可刺激MES分泌TNF-α水平升高，与阴性对照比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01），且随aIgA1浓度增加呈上升趋势。 结论 HSPN患儿aIgA1可刺激MES增殖及分泌TNF-α水平增加，且这一结果具有浓度依赖性及饱和性。

[关键词] 紫癜性肾炎；IgA1；系膜细胞；肿瘤坏死因子-α

[中图分类号] R725.5[文献标识码] A[文章编号] 1673-7210（2014）06（c）-0017-06

Effects of aIgA1 from children patients with henoch-schonlein purpura nephritis on glomerular mesangial cell proliferation and TNF-α secretion

CUI Yafan1 DING Ying2 YANG Xiaoqing2 DUAN Fengyang2 ZHAI Zonggang3 LIU Liya3

1.Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China; 2.Department of Pediatrics, the First Affiliated Hospital of He'nan University of TCM, He'nan Province, Zhengzhou 450003, China; 3.He'nan University of TCM, He'nan Province, Zhengzhou 450000, China

[Abstract] Objective To explore the effects of IgA1 isolated from both children patients with HSPN and healthy controls on proliferation and the level of TNF-α of MES. Methods Serum of 40 children with HSPN and 20 healthy children in the First Affiliated Hospital of He'nan University of TCM were collected from May to December 2013. IgA1 was purified from by Jacalin affinity chromatography and molecular sieve chromatography, then aggregated into aIgA1. MES was stimulated by different concentrations of aIgA1 with both children patients of HSPN and healthy controls, and the effects of different concentration aIgA1 on cells proliferation and the changes of secretion level for TNF-α were observed and contrasted. Results By the IgA1 stimulating of children patients with HSPN, there werestatistical differences among the MTT absorbency of mesangial cell in different concentration stimulation of aIgA1 (P < 0.05). Compared with negative control, the absorbency had statistically significant differences at the concentration of aIgA1 from 250 μg/mL to 1000 μg/mL of HSPN childern (P < 0.05), and the absorbency had high statistical significances at the concentration of aIgA1 from 500 μg/mL to 750 μg/mL of HSPN children at 24 h (P < 0.01). Compared with negative control, the absorbency had statistically significant difference at the concentration of aIgA1 in 50 μg/mL of HSPN children (P < 0.05), and the absorbency had high statistical significances at the concentration of aIgA1 from 100 to 1000 μg/mL of HSPN children at 48 h (P < 0.01). Compared with negative control, the absorbency had statistically significant differences at the concentration of aIgA1 from 750 μg/mL to 1000 μg/mL of healthy children (P < 0.05). Compared with negative control, aIgA1 of children patients with HSPN could stimulate the secretion of TNF-α, and the level of TNF-α of HSPN chiuldren had high statistical significances (P < 0.01). Conclusion The aIgA1 of children patients with HSPN can stimulate the cells proliferation and increase the secretion of TNF-α, and this result has the concentration-dependent and saturation.

[Key words] Henoch-schonlein purpura nephritis (HSPN); IgA1; Mesangial cell; Tumor necrosis factor-α

过敏性紫癜性肾炎（henoch-schonlein purpura nephritis，HSPN）是过敏性紫癜主要表现之一，是决定过敏性紫癜预后的最重要因素。在我国HSPN居小儿继发性肾病的首位，且近年来其发病率有上升趋势，严重危害着儿童健康[1]。IgA在HSPN的发病中起着重要的作用，有研究发现在过敏性紫癜患者急性期血清中IgA及IgA1水平均明显升高[2]，且有肾脏损害的患者血清IgA1水平较无肾脏损害的患者更高[3]，认为HSPN患者血中IgA尤其是IgA1水平升高。IgA在系膜区的沉积引起系膜细胞的增生是HSPN的主要病理改变，也是造成肾小球损伤的重要环节之一，且研究发现在其中主要起致病作用的是聚合型IgA1（polymeric IgA1，pIgA1）[4]。为了探讨HSPN患者的IgA1对系膜细胞损伤的影响，本研究拟通过MTT法观察HSPN患儿及健康儿童IgA1对系膜细胞增殖的影响，并通过ELISA法检测两种IgA1对系膜细胞分泌TNF-α的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

筛选2013年5～12月于河南中医学院第一附属医院儿科住院的40例HSPN患儿及同一时期的20名健康儿童作为研究对象。HSPN患儿符合临床HSPN诊断标准，男23例，女17例，年龄4～18岁，平均（9.15±2.94）岁。所有患儿尿沉渣检查红细胞5/HP～+++之间，尿蛋白+～+++，肝肾功能正常。除外系统性红斑狼疮、乙型病毒性肝炎等其他疾患。20名健康儿童，男8名、女12名，年龄3～14岁，平均（8.12±2.35）岁。近1个月无呼吸道、胃肠道等黏膜感染史，肝肾功能正常，无镜下血尿和蛋白尿。抽取患儿及健康儿童静脉血5 mL，室温下静置30 min后以3000 r/m离心15 min，收集血清于-70℃冻存备用。

1.2 主要试剂

Agarose-Jacalin亲和填料购自Invitrogen公司，蜜二糖购自aladdin公司，小鼠抗人IgAl-UNLB（clone b 3506B4）抗体购自Southern Biotechnology公司，HRP标记-山羊抗小鼠IgG（H+L）抗体购自中杉金桥公司，50 kD/2 mL超滤离心管购自pall公司，胎牛血清（FBS）购自GIBCO公司，DMEM/F-12 1∶1购自HyClone公司，噻唑蓝（MTT）购自Solarbio公司，小鼠肿瘤坏死因子定量酶联检测试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 IgA1的分离、纯化及鉴定采用Jacalin-agarose亲和层析联合分子筛层析法分离、纯化得到IgA1血清样品[5]。具体如下：用10 mmol/L PBS pH 7.4缓冲液等体积稀释，加至Jacalin亲和柱，流速0.5 mL/min，循环上样6次；用175 mmol/L Tris-HCl pH7.5缓冲液洗脱，直至洗脱液在280 nm的OD值小于1 mAU；收集亲和柱解离样品用超微量分光光度计测定其浓度；将解离样品用50 kD超滤膜，4℃，4000 r/min，浓缩到0.5 mL。经浓缩的Jacalin亲和柱解离样品于Superdex-200分子筛上样，用10 mmol/L PBS pH 7.4缓冲液进行洗脱，速度0.4 mL/min；通过280 nm的OD吸收值，收集洗脱峰，共4个峰；经SDS-PAGE电泳及鼠抗人IgA1及HRP标记的羊抗鼠抗体做Western Blot鉴定，证实2峰多聚体IgA1（pIgA1），3峰为单聚体IgA1（mIgA1）；收集2峰、3峰洗脱液，用超微量分光光度计测定其浓度。取mIgA1 63℃保温150 min，4℃下12000 r/min离心5 min，将mIgA1热聚合为aIgA1。

1.3.2 系膜细胞的培养小鼠肾小球系膜细胞（SV40 MES 13）购自上海中科院细胞库。用含5%胎牛血清（FBS）的DMEM/F-12 1∶1培养基培养，培养条件为37℃，95%空气和5%CO2的细胞培养箱，每2~3天换液1次，待细胞长至80%～90%融合时传代或冻存[6]。

1.3.3 aIgA1刺激系膜细胞后细胞增殖的测定采用MTT比色法，具体如下：将生长良好的SV40 MES 13细胞用含5%FBS的DMEM/F-12 1∶1培养基浓度稀释为2.5×104/mL，按每孔5000个、体积200 μL接种于96孔培养板中，置于条件为37℃、95%空气和5%CO2的细胞培养箱培养。待细胞贴壁后以含0.5%FBS的DMEM/F-12 1∶1培养基培养细胞18～24 h，使细胞同步化于G0期。用终浓度为50、100、250、500、750、1000 μg/mL的HSPN患儿及健康儿童aIgA1溶于含0.5%FBS的DMEM/F-12 1∶1培养基中，分别刺激细胞24 h和48 h，设1组用含0.5%FBS的DMEM/F-12 1∶1、不含刺激物的培养基培养为阴性对照组，另设1组用含5%FBS的DMEM/F-12 1∶1培养基培养为阳性对照组。在刺激结束前4 h，于每孔中加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，继续孵育4 h后终止培养。弃去上清液，每孔中加入150 μL DMSO吹打后，摇床上震荡10 min，使结晶充分溶解。酶标仪上检测每孔OD值，波长设为492 nm，以无细胞只加0.5%FBS的DMEM/F-12 1∶1培养基的溶液为基准调零。

1.3.4 aIgA1刺激系膜细胞后TNF-α分泌水平的测定采用以含0.5%FBS的DMEM/F-12 1∶1培养基稀释的终浓度为0、50、100、250、500 μg/mL HSPN患儿及健康儿童aIgA1刺激系膜细胞48 h，收集各组上清液保存于-70℃备用。实验前从冰箱中取出样品及酶联检测试剂盒及待测上清液平衡至室温。参照小鼠肿瘤坏死因子定量酶联检测试剂盒说明书建立标准曲线并进行样本检测，每个样本设5个复孔，酶标仪测量波长为450 nm，根据待查样本OD值在标准曲线中查出TNF-α含量。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0医用统计软件对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，重复测量的计量资料比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HSPN患儿及健康儿童血清IgA1浓度的比较

HSPN患儿pIgA1浓度为65～170 μg/mL，平均（124±34）μg/mL；mIgA1浓度为101～498 μg/mL，平均（346±92）μg/mL。健康儿童pIgA1浓度为58～95 μg/mL，平均（73±13）μg/mL；mIgA1浓度为131～234 μg/mL，平均（173±31）μg/mL。HSPN患儿mIgA1及pIgA1浓度均显著高于健康儿童，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。

2.2 aIgA1刺激系膜细胞对细胞增殖的影响

2.2.1 HSPN患儿aIgA1刺激系膜细胞24 h及48 h的MTT实验结果HSPN aIgA1刺激系膜细胞24 h后的MTT实验结果显示：与阴性对照比较，aIgA1刺激浓度达250 μg/mL时，细胞增殖差异有统计学意义（P < 0.05），且aIgA1刺激浓度在250、1000 μg/mL时，细胞增殖差异有统计学意义（P < 0.05），在aIgA1浓度为500、750 μg/mL时，细胞增殖差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。

表1 HSPN aIgA1刺激系膜细胞24 h MTT实验 OD值结果（n=5）

注：P值表示与阴性对照比较

48 h后的MTT实验结果显示：与阴性对照比较，aIgA1刺激浓度达50 μg/mL时，细胞增殖差异有统计学意义（P < 0.05），在100～1000 μg/mL的刺激浓度时与阴性对照相比较，细胞增殖差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表2。

表2 HSPN aIgA1刺激系膜细胞48 h MTT实验实验OD值结果（n=5）

注：P值表示与阴性对照比较

24 h及48 h aIgA1刺激系膜细胞增殖趋势图显示：aIgA1刺激浓度在0～500 μg/mL之间时随着浓度的增大，系膜细胞的增殖呈递增趋势；在500～750 μg/mL之间增殖达最高峰；而当aIgA1浓度增至1000 μg/mL，系膜细胞的增殖较前有所下降。见图1。

与阴性对照比较，*P < 0.05，&P < 0.01

图1 HSPN aIgA1刺激系膜细胞增殖24 h及48 h趋势图

2.2.2 健康儿童aIgA1刺激系膜细胞24 h及48 h的MTT实验结果健康儿童aIgA1刺激系膜细胞24 h后的MTT实验结果显示：与阴性对照组相比，aIgA1刺激浓度在0～500 μg/mL时，增殖结果与阴性对照比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；aIgA1刺激浓度在750～1000 μg/mL时，增殖结果与阴性对照比较，差异有统计学意义（P < 0.05），系膜细胞呈增殖趋势。见表3。

表3 健康儿童aIgA1刺激系膜细胞24 h MTT实验 OD值结果（n=5）

注：P值表示与阴性对照比较

48 h后的MTT实验结果显示：与阴性对照比较，aIgA1刺激浓度在0～500 μg/mL时，各浓度的增殖结果与阴性对照比较，差异无统计学意义（P > 0.05），aIgA1刺激浓度在750～1000 μg/mL之间时，增殖结果与阴性对照比较，差异有统计学意义（P < 0.05），系膜细胞呈增殖趋势。见表4。

表4 健康儿童aIgA1刺激系膜细胞48 h MTT实验OD值结果（n=5）

注：P值表示与阴性对照比较

24 h及48 h不同浓度组间比较的趋势图发现，在0～500 μg/mL之间无明显差异，在0～500 μg/mL之间随aIgA1浓度升高呈递增趋势。见图2。

2.3 aIgA1刺激系膜细胞后TNF-α分泌水平的影响

在用不同浓度HSPN和健康儿童血清aIgA1刺激系膜细胞48 h后收集细胞上清培养液用ELISA检测的TNF-α含量的结果显示：HSPN的aIgA1在50、100、250、500 μg/mL 4个刺激浓度下，均能刺激系膜细胞分泌的TNF-α含量增高，较阴性对照比较有差异高度统计学意义（P < 0.01），且含量呈递增趋势。健康儿童的aIgA1在50、100、250、500 μg/mL 4个刺激浓度下，刺激系膜细胞分泌的TNF-α含量与阴性对照比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图3。

与阴性对照比较，&P < 0.01

图3 HSPN及健康儿童aIgA1刺激系膜细胞分泌TNF-α水平变化

3 讨论

本研究采用Jaclin亲和层析联合Superdex-200分子筛层析成功的将血清中的mIgA1及pIgA1分离出来，并发现血清中以mIgA1为主要存在形式，与以往文献报道相符[7]，通过热聚合的方式可以将IgA1单体聚合为聚合体形式。

肾小球系膜细胞具有很多功能，它在结构上支撑毛细血管[8]，还具有内分泌功能，分泌肾素和多种酶类物质对肾小球内血流量进行局部调节[9]，可以分泌细胞基质，具有单核-巨噬细胞的作用吞噬和清除沉积于系膜区的大分子物质，可以分泌、产生多种细胞因子介导各种免疫反应，还有似平滑肌细胞的收缩功能从而调节肾小球的滤过率[10]。HSPN的主要病理改变之一是系膜细胞的增生，系膜细胞增生后可分泌大量的细胞因子，激活多种免疫反应机制，可促进炎性反应的发生，导致大量炎症细胞的浸润，并可使分泌的大量细胞外基质在系膜区聚集、沉积，如Ⅰ型和Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白等，从而引起肾小球的纤维化[11-13]。目前在IgA1对系膜细胞损伤的研究中，多以IgA肾病为模型，针对HSPN的研究少见，研究发现在IgA肾病中，IgA1存在结构异常，即IgA1的铰链区与O-糖基链的上的GalNAc连接位点减少有关，呈低糖基化。异常糖基化IgA1不易与肝细胞接触，从而顺利通过肾小球系膜细胞沉积于系膜区，且与系膜细胞上的IgA1特异性受体结合能力增强，更容易黏附于系膜细胞上[14-15]，触发了系膜细胞的活化、增殖，多种炎性细胞因子（如TNF-α、IL-6等）的释放，促使系膜基质的增生，纤连蛋白和胶原等在肾小球沉积，最终形成肾小球纤维化[16-17]。Lai等[18]发现在IgA肾病中，由系膜细胞分泌、合成的TNF-ɑ是导致肾小球-小管损伤的很重要的一个介质。并通过研究发现在IgA肾病中系膜细胞的分泌的TNF-ɑ可以中和抗TNF-ɑ抗体，促进足细胞分泌TNF-ɑ，并可以上调TNF-α受体1及TNF-α受体2的表达，造成肾脏损伤加重。因HSPN与IgA肾病具有相似的系膜细胞上的病理改变，且在HSPN患者中的IgA1也同样存在异常糖基化[19]，据此本研究推测HSPN患者的IgA1是否可以通过触发系膜细胞的活化增殖及细胞因子的释放，从而造成肾小球的损伤。

在用不同浓度的HSPN患儿及健康儿童的aIgA1刺激系膜细胞的MTT实验结果提示：HSPN及健康儿童的aIgA1均能刺激系膜细胞增生，但作用浓度不同。在24 h结果中，HSPN组的aIgA1在250 μg/mL浓度下可出现系膜细胞的增殖，且随浓度的增高增殖越明显，而健康儿童的aIgA1在750 μg/mL才出现细胞的增殖。在48 h结果中，HSPN组的作用更明显，aIgA1在50 μg/mL浓度下可出现系膜细胞的增殖，且随浓度的增高增殖越明显，而这种增殖趋势在500、750 μg/mL时达到最明显，而在1000 μg/mL时反而出现了增殖趋势下降的表现；而健康儿童的aIgA1在750 μg/mL才出现细胞的增殖的表现。HSPN患儿aIgA1刺激系膜细胞的MTT增殖实验结果说明aIgA1刺激系膜细胞导致的细胞增殖具有浓度依赖性及饱和性，即在一定浓度范围内，aIgA1的浓度越高，对系膜细胞的增殖作用越明显，而当达到一定浓度时，这种增殖作用达到饱和不会再增强反而会逐渐减弱。健康儿童aIgA1在低浓度下不能刺激系膜细胞增殖，只有在高浓度范围内才会引起系膜细胞增殖明显。比较两种来源aIgA1所产生刺激结果不同的原因主要考虑有两方面：一是高浓度的aIgA1对系膜细胞本身有毒性作用，即在高浓度状态下，刺激系膜细胞的增殖是非特异性的，而是因为刺激物对细胞毒性反应产生的细胞损伤表现；另外一种可能就是在健康儿童IgA中也存在致病的IgA1类型，但是含量较少，而当致病IgA1浓度达到一定水平后，也可刺激系膜细胞导致其增殖。另外aIgA1刺激系膜细胞导致的细胞增殖还具有时效性，48 h的细胞增殖较24 h的增殖更显著。本研究通过ELISA的方法检测HSPN及健康儿童两组不同浓度的aIgA1刺激系膜细胞48 h分泌的TNF-α的含量变化的结果发现，在0～500 μg/mL范围内HSPN的aIgA1刺激系膜细胞后可导致TNF-α的分泌增多，且TNF-α的含量随刺激的aIgA1浓度的升高而增加更明显，即这个结果与aIgA1的浓度呈正相关；而健康儿童的aIgA1不能刺激系膜细胞分泌更多的TNF-α。

根据以上结果推测，HSPN患儿的IgA1因其分子结构或功能的异常更易于在肾脏沉积，易于与系膜细胞结合，从而导致系膜细胞的活化、增殖，并且诱导系膜细胞分泌更多的TNF-α，产生的炎性介质进一步参与的肾小球的损伤过程。

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（收稿日期：2014-03-18本文编辑：苏畅）

根据以上结果推测，HSPN患儿的IgA1因其分子结构或功能的异常更易于在肾脏沉积，易于与系膜细胞结合，从而导致系膜细胞的活化、增殖，并且诱导系膜细胞分泌更多的TNF-α，产生的炎性介质进一步参与的肾小球的损伤过程。

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（收稿日期：2014-03-18本文编辑：苏畅）

根据以上结果推测，HSPN患儿的IgA1因其分子结构或功能的异常更易于在肾脏沉积，易于与系膜细胞结合，从而导致系膜细胞的活化、增殖，并且诱导系膜细胞分泌更多的TNF-α，产生的炎性介质进一步参与的肾小球的损伤过程。

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（收稿日期：2014-03-18本文编辑：苏畅）