阶梯缓释抗结核纳米人工骨复合体的生物安全性研究

席焱海++++何海龙++李坤++++++刘希麟++薛敏涛+++++徐宁+++叶晓健

[摘要] 目的 研究阶梯缓释抗结核纳米人工骨复合体（β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA）的生物安全性。 方法 对β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA复合体进行体外噻唑蓝（MTT）细胞毒性实验，动物体内急性全身毒性实验、原发性皮肤刺激实验、皮内刺激实验和致敏实验，并设置对照组进行比较。 结果 β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA复合体MTT细胞毒性实验显示人工骨材料组细胞存活率在95%以上，细胞毒性1级。人工骨复合材料浸取液不引起豚鼠过敏。原发性皮肤刺激实验和皮内刺激实验均提示复合材料对兔皮肤、皮内无刺激反应。小鼠尾静脉注射后未出现明显全身毒性反应。 结论 β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA无明显细胞毒性，具有良好的细胞相容性，在应用过程中能够降低直接使用抗结核药物所带来的生物毒性。动物全身毒性反应、皮肤/内刺激反应和急性过敏反应提示该材料具有良好的生物安全性。

[关键词] 结核；药物缓释；纳米；生物安全性

[中图分类号] R943[文献标识码] A[文章编号] 1673-7210（2014）06（c）-0022-05

Biological security of ladder-sustained-release anti-TB drugs artificial composite bone

XI Yanhai HE Hailong LI Kun LIU Xilin XUE Mintao XU Ning YE Xiaojian▲

Department of Spinal Surgery, Orthopaedic Hospital of Shanghai Changzheng Hospital, the Second Military Medical University, Shanghai 200003, China

[Abstract] Objective To investigate the biological security of ladder-sustained-release anti-TB drugs artificial composite bone (β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA). Methods MTT toxicity test, acute systemic toxicity test, intracutaneous irritation test and skin sensitization in stimulation were performed in the ladder-sustained-release anti-TB drugs artificial composite bone. The results were compared with control group. Results MTT toxicity test showed that the survival rate of bone cells in artificial materials was more than 95% and cytotoxicity was on grade 1. Artificial bone composite material liquid did not cause allergic reaction in guinea pig. Primary skin irritation experiments and intradermal stimulation experiment suggested that composite materials to rabbit skin and intracutaneous no stimulation reaction. No obvious systemic toxic reaction was found in mice after intravenous injection. Conclusion There is no MTT cytotoxicity in the ladder-sustained-release anti-TB drugs artificial composite bone. It can reduce the biological toxicity of anti-TB drugs and will not cause systemic toxic reaction, skin/hypodermic stimulation reactions and acute allergic reaction. It has good cell compatibility and biological security.

[Key words] Tuberculosis; Drug-release; Nanometer; Biosecurity

病灶清除术后骨缺损区植骨治疗是骨结核病常用的手术治疗手段，与此同时，全身使用抗结核药物仍是必要的。然而全身用药方式实际到达局部病灶的浓度很低，甚至在血供不丰富的局部组织抗结核药物根本无法到达。病灶清除后使用搭载缓释型抗结核药物人工骨材料进行植骨来加强抗局部抗结核治疗是一种有效的治疗方式。考虑到结核药物治疗需要遵循长程、联合、足量等原则，本研究设计出一种新型搭载利福平（RFP）、异烟肼（INH）、硫酸链霉素三药抗结核药物的阶梯缓释型人工骨材料。通过静电纺丝技术以高分子聚合物聚己内酯（PCL）为载体，制得负载RFP、INH两药的电纺纳米纤维薄膜，用压片机将其与磷酸三钙（β-TCP）、PCL等赋形剂混合压制得到人工骨，将硫酸链霉素（SM）和海藻酸钠（SA）与得到的人工骨通过交联固化方式最终制备成阶梯缓释抗结核纳米人工骨（β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA）。对生物材料进行有效性和安全性评价是生物材料进入临床前的关键环节。因此本实验拟通过体外噻唑蓝（MTT）细胞毒性实验，动物体内急性全身毒性实验、皮肤/皮内刺激实验和致敏实验，并设置对照组进行比较，对该复合材料其生物安全性进行测试，以证实其生物安全性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA制备：精密称定分子量为8万的PCL 0.24 g，RFP粉末0.012 g，INH粉末0.012 g，加入氯仿，得到的溶液在30℃，电压为15 kV，流量为0.5 mL/h，接收距离为21 cm的条件下纺丝4 h，分别得到含INH和RFP的药膜。精密称定特制粉末[β-TCP∶PCL∶NaCl（1∶8∶1）]0.1 g放置于模具中，与INH药膜、RFP药膜交替加载。使用粉末压片机在14 kPa压力下，压制2 min，取出，放置去离子水中浸泡72 h，除去NaCl，取出，晾干，得到β-TCP/INH-RFP-PCL。精确称取质量百分比浓度为1 mg/mL的SA 10 g，SM 5 g，氯化钙10 g，SA和SM加8.5 mL去离子水搅拌溶解，氯化钙用10 mL去离子水溶解，将含有INH和RFP的去盐人工骨置于SA溶液中超声浸泡5 min，接着置于氯化钙溶液中交联固化10 min，该混合物取出晾干，即可制得抗结核药物微球复合体β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA。每克复合体中INH、RFP、SM三种药的载药量分别达到0.04、0.08、0.10 g。

1.2 实验方法

1.2.1 β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA复合体细胞毒性的MTT测定以MC-3T3为实验细胞，设置空白组、对照组、实验组，实验组分为①β-TCP组；②INH-RFP-SM直接给药组，根据药物最低杀菌浓度分为：半量最低杀菌浓度、最低杀菌浓度、2倍最低杀菌浓度；③β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA复合体组。MC3T3-E1细胞放置α-MEM培养液中生长，待细胞长成单层后传代，移去培养液，0.25%胰蛋白酶消化，37℃条件下消化1～2 min，加入适量的α-MEM培养液，调配至细胞分散均匀，制成1×104/cm2的细胞悬液，接种于96孔板中培养板，在37℃、5%CO2培养箱中培养1 d，使细胞贴壁，移除培养基。在37℃、5%CO2环境下，用α-MEM培养基按材料表面积/溶液量（cm2/mL）=2的比例进行浸提72 h后，收集浸提液，然后用0.2 μm的微孔滤膜过滤除菌备细胞实验用。加入50 μL的α-MEM培养基（含10%FBS）及50 μL的浸提液作为实验组；在α-MEM培养基中不加入浸提液及细胞的作为空白组；在α-MEM培养基（含10%FBS）中不加入浸提液的作为对照组。在37℃、5%CO2条件下，在不同培养基中分别培养至7 d。然后采用MTT法检测吸光度值，即分别培养1、4、7 d后每孔加入20 μL的MTT（5 mg/L）试剂孵育4 h后，弃上清液，再加入100 μL二甲亚砜（DMSO），震荡10 min后置入在490 nm波长下，在免疫酶标仪上检测各孔的吸光度（OD值）。计算活细胞的存活率SR（cell survival rate）。SR=（实验组OD-空白组OD）/（对照组OD-空白组OD）×100%。最后转化为相应的细胞毒性等级，标准为：0级 ≥ 100%；1级75%～<100%；2级50%～<75%；3级25%～<50%；4级0%～<25%；5级<0%。

1.2.2 致敏实验选择实验用成年豚鼠20只（雌雄不拘），3个月龄，体重350～400 g。操作方法：以豚鼠两侧肩胛骨内缘处进行皮内注射。实验材料浸提液制备：将1 g复合材料于生理盐水中浸提72 h（37℃）。设置分组：实验组10只：注射实验材料浸取液0.1 mL；阴性对照组5只：注射生理盐水0.1 mL；阳性对照组5只，注射2%二硝基氟苯0.1 mL。注射完成后1、2、3 d分别观察各组皮肤反应情况，皮肤反应分类标准见表1。每组出现阳性反应的动物数超过总数30%即判定该组为变态反应致敏阳性。

表1 皮肤反应分类标准

1.2.3 皮肤刺激实验使用清洁级健康成年新西兰兔6只，雌雄兼用，品系、饲养条件统一，体重不低于2 kg。实验前1天将实验用兔固定后，于兔背部脊柱两侧被毛（约10 cm×15 cm区域，用8%硫化钠溶液进行脱毛）。设置12片被皮区，大小为25 mm×25 mm，脊柱左右各6片，其中6片实验组，3片阳性对照组，3片阴性对照组。实验组使用滤纸或纱布块充分吸附复合材料的浸提液（制备过程同致敏实验）至饱和，阴性对照组吸附生理盐水，阳性对照组吸附3.5%甲醛溶液，贴敷于消毒后的实验部位，阴、阳对照组与实验组交叉放置。用包扎带进行半封闭式固定4 h以上，去除包扎带和贴敷物，用温水清洁贴敷区并吸干，观察皮肤的红斑及水肿情况。分别在1、2、3 d时间点记录各接触部位情况，如存在持久性损伤有必要延长观察时间，以判断损伤是否可逆。最后参考表1皮肤反应分类标准进行记分，并计算原发刺激指数（primary stimulus index，PSI）：PSI=1、2、3 d的红斑、水肿总分/观察总数。反应类型结果评价为：无刺激0～<0.5分；轻度刺激0.5～<2.0分；中度刺激2.0～<5.0分；强刺激5.0～8.0分。

1.2.4 皮内刺激实验使用清洁级健康成年新西兰兔4只，雌雄兼用，品系、饲养条件统一，体重不低于2 kg。实验前1天将实验用兔固定后，于兔背部脊柱两侧被毛（约10 cm×20 cm区域，用8%硫化钠溶液进行脱毛）。实验动物脊柱两侧旁开2.5 cm纵线上各取10个皮内注射点，每点间距2 cm。一侧注射复合材料浸取液（制备过程同致敏实验）0.2 mL，另一侧注射生理盐水作0.2 mL为对照。注射后于1、2、3 d观察局部及周围皮肤组织反应，并按表1所列标准进行记分，再根据记分结果推算PSI和平均原发刺激指数（average primary stimulus index，APSI），APSI=所有动物PSI总和/动物数。反应类型结果评价同皮肤刺激实验。

1.2.5 急性全身毒性实验采用实验验用小鼠健康合格，同一品系，须在同一饲养条件下饲养，雌雄不拘，雌鼠应无孕，体重17～23 g。将小鼠随机分为实验组和对照组，每组10只。将小鼠放入固定器内，自尾静脉分别注入复合材料浸提液（制备过程同致敏实验）（实验组）和生理盐水（对照组），注射剂量为50 mL/kg，注射速度为0.1mL/s。注射完毕后，观察小鼠即时反应，如发现有血或供试液外溢现象，弃去此小鼠，另取小鼠依法操作。实验后饲养法同实验前，并于1、2、3 d，观察和记录实验组和对照组动物的一般状态、毒性表现和死亡动物数。实验组和对照组小鼠如出现中毒表现，则根据其症状程度记为无中毒、轻度中毒、明显中毒、重度中毒和死亡，急性全身毒性实验中的动物反应指标见表2。根据观察结果作出评价。

表2 急性全身毒性实验中的动物反应指标

2 结果

2.1 MTT细胞毒性实验

β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA复合体采用MTT法观察并通过计算生存率方式测试复合体的细胞毒性。结果见图1。β-TCP组7 d内的生存率为基本为100%，三种抗结核药直接给药组细胞存活率相对较低，低于90%，β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA复合体实验组7 d内存活率>95%。说明本实验材料具有良好细胞相容性，无明显的细胞毒性。细胞毒性等级，空白对照组：0级；实验组：1级；RFP直接给药组：1级。

①：半量最低杀菌浓度；②：最低杀菌浓度；③：2倍最低杀菌浓度

图1 噻唑蓝细胞毒性实验结果

2.2致敏实验

实验组所有豚鼠未出现明显皮肤过敏反应，与生理盐水阴性对照组结果相同；注射二硝基氟苯阳性对照组豚鼠全部出现过敏反应，超过总数30%判定为致敏阳性。

2.3原发性皮肤刺激实验

β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA复合体实验组在家兔皮肤实验区域未见红斑、水肿，PSI指数为0，评价为无刺激，同生理盐水阴性对照组。而3.5%甲醛溶液阳性对照组PSI为3，评价为对皮肤中度刺激。见表3。

表3 各组别不同时间下原发性皮肤刺激实验皮肤反应得分情况

2.4皮内刺激实验

β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA复合材料实验组在实验后1、2、3 d红斑和水肿情况基本为无，少数有微弱红斑、水肿反应。通过各个时间点结果记分，计算出刺激指数，最后计算出平均刺激指数实验组为0.32，对照组为0.11。各实验组刺激指数和平均刺激指数评价为无刺激，同生理盐水对照组。见表4。

表4 各组不同动物编号皮内刺激实验结果

2.5急性全身毒性实验

β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA复合材料实验组小鼠尾静脉注射后1、2、3 d进行观察，有2只小鼠1 d时出现轻度精神异常，2 d后恢复，余小鼠未见明显异常表现，评价结果为无中毒。对照组所有小鼠无不良反应出现，同样评价为无中毒。延长观察时间至2周，小鼠未见明显异常。见表5。

表5 不同组别不同急性全身毒性实验结果

3 讨论

组织工程生物材料由于要长期甚至终生与人体相接触，因此对其安全性的评价非常重要。本文实验对象的阶梯缓释抗结核人工骨复合材料主要包括β-TCP、PCL、SA、INH、RFP和SM三种抗结核药物。其中β-TCP作为骨支架材料，在临床和各类实验研究均得到广泛应用，取得良好的经济效益和社会效益。该材料具有较强的细胞相容性，降解完全，能够与周围的正常的骨组织直接结合，达到可靠的骨修复作用[1]。以β-TCP为基础制备的多种复合材料或载药材料均具有良好的生物相容性及安全性[2-4]。PCL是化学合成的生物降解性高分子材料。它的分子结构中引入了酯基结构，在自然界中酯基结构易被微生物或酶分解，最终产物为CO2和H2O，具有良好的生物降解性、生物相容性和无毒性，而被广泛用作医用生物降解材料及药物控制释放体系[5-7]。SA属天然有机高分子化合物，同样具有药物制剂辅料所需的稳定性、溶解性、黏性和安全性。能够作为释放和包埋RFP等药物的载体[8]，并被证实安全有效。笔者在既往研究中制备了单载RFP抗结核药物的缓释型人工骨复合体（TPB/SA-RFP/PLA、PLGA、PCL），具有良好的释药效能和成骨性能的同时兼具良好的生物安全性[9-10]。证实使用多种复合材料并搭载合理浓度的药物制备的生物材料是安全可行的。

本研究在制作单载抗结核药物复合人工骨的基础上，通过工艺的改进并引进静电纺丝技术，研制出搭载3种抗结核药物的新型人工骨复合物β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA，具有较大的表面孔径，呈多孔形态，孔隙率较大，微孔分布均匀，孔径内部光滑，内部附着载药纳米纺丝纤维与多孔间连接，结构稳定。静电纺丝工艺是通过静电力的作用来合成纤维。其制备的纳米纤维能够模仿组织器官的细胞外基质的结构尺寸。纤维支架具有相互连接的空隙的多孔结构和优越的比表面，利于细胞的黏附及生长。可将不同聚合物的共混，并且加入无机材料等添加物制各成复合纤维以适应不同需求[11]。使用静电纺丝法工艺，可以很方便对搭载药物的载体进行塑形，同时载药膜具备较大的接触面积易于药物搭载和释放。利用静电纺丝技术制作的组织工程支架、载药载体等均证实具有良好的生物相容性及安全性[12-14]。其载药量在局部能实现长达3个月有效缓释，局部药物缓释浓度能达到每种药品的最低杀菌浓度。该材料主要成分在既往实验中虽已获得生物安全性认可，但复合后并搭载3种抗结核药物研制成的新型复合材料，其安全性如何，是否对人体具有毒性、致癌致病性、致畸性或其他潜在危害，仍是必须关注的问题。同时一种医用材料在正式投入生物体研究或临床应用前，必须依照国家有关标准[15-16]，对其进行生物安全性评价。

对生物材料的生物安全性评价方法主要有两类[17]：动物体内实验和体外实验。前者是将材料植入实验动物体内后，观察材料及周围组织病理变化，评价组织相容性。后者是用材料或材料浸提液，在动物体外进行一系列研究，测试材料对组织细胞增殖、生长、分化等活动的影响，以MTT细胞毒性实验为代表[18]。这一方法被广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测，目前己成为生物材料和医疗器械生物评价体系中最重要的指标之一。其在分析生物材料是否具有毒性和对细胞的影响方面比体内实验具有更高的敏感性。本实验材料β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA复合体最终需要在体内长期内置，因此根据国家制定医用材料生物安全性评价要求，选用致敏实验、原发性皮肤刺激实验、皮内刺激实验和急性全身毒性实验评价本材料的生物安全性。

本实验结果显示新型人工骨复合物β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA材料在MTT实验中7 d内细胞存活率>95%，较空白对照组稍低，但明显高于RFP直接给药阳性对照组<85%，说明本实验材料具有良好细胞相容性，无明显的细胞毒性。材料组中抗结核药物载量远高于直接给药组，而细胞存活率却较高，说明抗结核药物在复合入生物材料并制备成缓释形态后，能够降低抗结核药物直接给药所产生的毒性。致敏实验、原发性皮肤刺激实验、皮内刺激实验、急性全身毒性实验等体内实验结果表明本实验材料无毒，无致敏性。因此，阶梯缓释抗结核药物纳米人工骨复合材料（β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA）具有良好的生物相容性和安全性，能够投入到进一步的生物体实验研究中。

[参考文献]

[1]LeGeros RZ. Biodegradation and bioresorption of calcium phosphate ceramics [J].Clin Mater，1993，14（1）：65-88.

[2]胡红涛.孔壁表现纳米化的nHA晶须增强多孔骨支架的制备与性能研究[D].上海：第二军医大学，2012.

[3]张智星.控释性可注射牙槽骨修复材料的生物学性能研究[D].武汉：华中科技大学，2009.

[4]郭洪刚，刘静，李峰坦，等.新型纳米化仿生骨基质与羊脂肪基质细胞复合培养的生物相容性[J].中国组织工程研究，2012，16（16）：2889-2892.

[5]王昊，周志平，戴晓晖，等.温敏性聚己内酯-聚N-异丙基丙烯酰胺作为抗癌药物载体的制备与药物释放的研究[J].功能材料，2013，44（3）：435-441.

[6]王永生.VEGF-BSA/PCL-PEG同轴纳米纤维缓释载体的构建及体外血液相容性和生物学活性的研究[D].武汉：华中科技大学，2012.

[7]Tseng H，Puperi DS，Kim EJ，et al. Anisotropic poly（ethylene glycol）/polycaprolactone （PEG/PCL） hydrogel-fiber composites for heart valve tissue engineering [J]. Tissue Eng Part A，2014，8：10.

[8]石拯拯，李海斌，曹建霞，等.利福平海藻酸钠微球栓塞剂的制备及体外释药研究[J].实用医学杂志，2013，29（11）：1727-1730.

[9]席焱海，薛敏涛，叶晓健，等.交联可调式抗结核药物缓释型纳米人工骨体内成骨的观察[J].中华医学杂志，2013， 93（19）：1494-1498.

[10]席焱海，薛敏涛，叶晓健，等.交联可调式抗结核药物缓释型纳米人工骨复合体的生物安全性研究[J].脊柱外科杂志，2012，10（4）：247-250.

[11]Zhang YZ， OUYang HW， Chwee TL，et al. Electrospinning of gelatin fibers and gelatin/PCL composite fibrous scaffolds [J]. Wiley Inter Science，2004，（72）：156-165.

[12]马骁.静电纺丝制备PLGA三维组织工程支架的研究[D].大连：大连医科大学，2013.

[13]何莉，王立新，张幼珠，等.载药聚乳酸纤维膜的制备及释药性能研究[J].合成纤维，2007，36（9）：19-21，25.

[14]赵俊成.负载凝血酶可溶性鸡蛋壳膜蛋白-聚丁二酸丁二醇酯共同静电纺丝止血材料的研究[D].北京：解放军军医进修学院，2013.

[15]国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.医用有机硅材料生物学评价试验方法[S].北京：中国标准出版社，GB/T 16175-2008.

[16]国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.医疗器械生物学评价——第1部分：风险管理过程中的评价与试验[S].北京：中国标准出版社，GB/T 16886.1-2011.

[17]张真，卢晓风，李幼平，等.生物材料有效性和安全性评价的现状与趋势[J].生物医学工程学杂志，2002，19（1）：117-121.

[18]Srivastava S，Gorham SD，Courtney JM. Screening of in vitro cytotoxicity by the adhesive test [J]. Biomaterials，1990， 11（2）：133-137.

（收稿日期：2014-03-16本文编辑：卫轲）

2.5急性全身毒性实验

β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA复合材料实验组小鼠尾静脉注射后1、2、3 d进行观察，有2只小鼠1 d时出现轻度精神异常，2 d后恢复，余小鼠未见明显异常表现，评价结果为无中毒。对照组所有小鼠无不良反应出现，同样评价为无中毒。延长观察时间至2周，小鼠未见明显异常。见表5。

表5 不同组别不同急性全身毒性实验结果

3 讨论

组织工程生物材料由于要长期甚至终生与人体相接触，因此对其安全性的评价非常重要。本文实验对象的阶梯缓释抗结核人工骨复合材料主要包括β-TCP、PCL、SA、INH、RFP和SM三种抗结核药物。其中β-TCP作为骨支架材料，在临床和各类实验研究均得到广泛应用，取得良好的经济效益和社会效益。该材料具有较强的细胞相容性，降解完全，能够与周围的正常的骨组织直接结合，达到可靠的骨修复作用[1]。以β-TCP为基础制备的多种复合材料或载药材料均具有良好的生物相容性及安全性[2-4]。PCL是化学合成的生物降解性高分子材料。它的分子结构中引入了酯基结构，在自然界中酯基结构易被微生物或酶分解，最终产物为CO2和H2O，具有良好的生物降解性、生物相容性和无毒性，而被广泛用作医用生物降解材料及药物控制释放体系[5-7]。SA属天然有机高分子化合物，同样具有药物制剂辅料所需的稳定性、溶解性、黏性和安全性。能够作为释放和包埋RFP等药物的载体[8]，并被证实安全有效。笔者在既往研究中制备了单载RFP抗结核药物的缓释型人工骨复合体（TPB/SA-RFP/PLA、PLGA、PCL），具有良好的释药效能和成骨性能的同时兼具良好的生物安全性[9-10]。证实使用多种复合材料并搭载合理浓度的药物制备的生物材料是安全可行的。

本研究在制作单载抗结核药物复合人工骨的基础上，通过工艺的改进并引进静电纺丝技术，研制出搭载3种抗结核药物的新型人工骨复合物β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA，具有较大的表面孔径，呈多孔形态，孔隙率较大，微孔分布均匀，孔径内部光滑，内部附着载药纳米纺丝纤维与多孔间连接，结构稳定。静电纺丝工艺是通过静电力的作用来合成纤维。其制备的纳米纤维能够模仿组织器官的细胞外基质的结构尺寸。纤维支架具有相互连接的空隙的多孔结构和优越的比表面，利于细胞的黏附及生长。可将不同聚合物的共混，并且加入无机材料等添加物制各成复合纤维以适应不同需求[11]。使用静电纺丝法工艺，可以很方便对搭载药物的载体进行塑形，同时载药膜具备较大的接触面积易于药物搭载和释放。利用静电纺丝技术制作的组织工程支架、载药载体等均证实具有良好的生物相容性及安全性[12-14]。其载药量在局部能实现长达3个月有效缓释，局部药物缓释浓度能达到每种药品的最低杀菌浓度。该材料主要成分在既往实验中虽已获得生物安全性认可，但复合后并搭载3种抗结核药物研制成的新型复合材料，其安全性如何，是否对人体具有毒性、致癌致病性、致畸性或其他潜在危害，仍是必须关注的问题。同时一种医用材料在正式投入生物体研究或临床应用前，必须依照国家有关标准[15-16]，对其进行生物安全性评价。

对生物材料的生物安全性评价方法主要有两类[17]：动物体内实验和体外实验。前者是将材料植入实验动物体内后，观察材料及周围组织病理变化，评价组织相容性。后者是用材料或材料浸提液，在动物体外进行一系列研究，测试材料对组织细胞增殖、生长、分化等活动的影响，以MTT细胞毒性实验为代表[18]。这一方法被广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测，目前己成为生物材料和医疗器械生物评价体系中最重要的指标之一。其在分析生物材料是否具有毒性和对细胞的影响方面比体内实验具有更高的敏感性。本实验材料β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA复合体最终需要在体内长期内置，因此根据国家制定医用材料生物安全性评价要求，选用致敏实验、原发性皮肤刺激实验、皮内刺激实验和急性全身毒性实验评价本材料的生物安全性。

本实验结果显示新型人工骨复合物β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA材料在MTT实验中7 d内细胞存活率>95%，较空白对照组稍低，但明显高于RFP直接给药阳性对照组<85%，说明本实验材料具有良好细胞相容性，无明显的细胞毒性。材料组中抗结核药物载量远高于直接给药组，而细胞存活率却较高，说明抗结核药物在复合入生物材料并制备成缓释形态后，能够降低抗结核药物直接给药所产生的毒性。致敏实验、原发性皮肤刺激实验、皮内刺激实验、急性全身毒性实验等体内实验结果表明本实验材料无毒，无致敏性。因此，阶梯缓释抗结核药物纳米人工骨复合材料（β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA）具有良好的生物相容性和安全性，能够投入到进一步的生物体实验研究中。

[参考文献]

[1]LeGeros RZ. Biodegradation and bioresorption of calcium phosphate ceramics [J].Clin Mater，1993，14（1）：65-88.

[2]胡红涛.孔壁表现纳米化的nHA晶须增强多孔骨支架的制备与性能研究[D].上海：第二军医大学，2012.

[3]张智星.控释性可注射牙槽骨修复材料的生物学性能研究[D].武汉：华中科技大学，2009.

[4]郭洪刚，刘静，李峰坦，等.新型纳米化仿生骨基质与羊脂肪基质细胞复合培养的生物相容性[J].中国组织工程研究，2012，16（16）：2889-2892.

[5]王昊，周志平，戴晓晖，等.温敏性聚己内酯-聚N-异丙基丙烯酰胺作为抗癌药物载体的制备与药物释放的研究[J].功能材料，2013，44（3）：435-441.

[6]王永生.VEGF-BSA/PCL-PEG同轴纳米纤维缓释载体的构建及体外血液相容性和生物学活性的研究[D].武汉：华中科技大学，2012.

[7]Tseng H，Puperi DS，Kim EJ，et al. Anisotropic poly（ethylene glycol）/polycaprolactone （PEG/PCL） hydrogel-fiber composites for heart valve tissue engineering [J]. Tissue Eng Part A，2014，8：10.

[8]石拯拯，李海斌，曹建霞，等.利福平海藻酸钠微球栓塞剂的制备及体外释药研究[J].实用医学杂志，2013，29（11）：1727-1730.

[9]席焱海，薛敏涛，叶晓健，等.交联可调式抗结核药物缓释型纳米人工骨体内成骨的观察[J].中华医学杂志，2013， 93（19）：1494-1498.

[10]席焱海，薛敏涛，叶晓健，等.交联可调式抗结核药物缓释型纳米人工骨复合体的生物安全性研究[J].脊柱外科杂志，2012，10（4）：247-250.

[11]Zhang YZ， OUYang HW， Chwee TL，et al. Electrospinning of gelatin fibers and gelatin/PCL composite fibrous scaffolds [J]. Wiley Inter Science，2004，（72）：156-165.

[12]马骁.静电纺丝制备PLGA三维组织工程支架的研究[D].大连：大连医科大学，2013.

[13]何莉，王立新，张幼珠，等.载药聚乳酸纤维膜的制备及释药性能研究[J].合成纤维，2007，36（9）：19-21，25.

[14]赵俊成.负载凝血酶可溶性鸡蛋壳膜蛋白-聚丁二酸丁二醇酯共同静电纺丝止血材料的研究[D].北京：解放军军医进修学院，2013.

[15]国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.医用有机硅材料生物学评价试验方法[S].北京：中国标准出版社，GB/T 16175-2008.

[16]国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.医疗器械生物学评价——第1部分：风险管理过程中的评价与试验[S].北京：中国标准出版社，GB/T 16886.1-2011.

[17]张真，卢晓风，李幼平，等.生物材料有效性和安全性评价的现状与趋势[J].生物医学工程学杂志，2002，19（1）：117-121.

[18]Srivastava S，Gorham SD，Courtney JM. Screening of in vitro cytotoxicity by the adhesive test [J]. Biomaterials，1990， 11（2）：133-137.

（收稿日期：2014-03-16本文编辑：卫轲）

2.5急性全身毒性实验

β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA复合材料实验组小鼠尾静脉注射后1、2、3 d进行观察，有2只小鼠1 d时出现轻度精神异常，2 d后恢复，余小鼠未见明显异常表现，评价结果为无中毒。对照组所有小鼠无不良反应出现，同样评价为无中毒。延长观察时间至2周，小鼠未见明显异常。见表5。

表5 不同组别不同急性全身毒性实验结果

3 讨论

组织工程生物材料由于要长期甚至终生与人体相接触，因此对其安全性的评价非常重要。本文实验对象的阶梯缓释抗结核人工骨复合材料主要包括β-TCP、PCL、SA、INH、RFP和SM三种抗结核药物。其中β-TCP作为骨支架材料，在临床和各类实验研究均得到广泛应用，取得良好的经济效益和社会效益。该材料具有较强的细胞相容性，降解完全，能够与周围的正常的骨组织直接结合，达到可靠的骨修复作用[1]。以β-TCP为基础制备的多种复合材料或载药材料均具有良好的生物相容性及安全性[2-4]。PCL是化学合成的生物降解性高分子材料。它的分子结构中引入了酯基结构，在自然界中酯基结构易被微生物或酶分解，最终产物为CO2和H2O，具有良好的生物降解性、生物相容性和无毒性，而被广泛用作医用生物降解材料及药物控制释放体系[5-7]。SA属天然有机高分子化合物，同样具有药物制剂辅料所需的稳定性、溶解性、黏性和安全性。能够作为释放和包埋RFP等药物的载体[8]，并被证实安全有效。笔者在既往研究中制备了单载RFP抗结核药物的缓释型人工骨复合体（TPB/SA-RFP/PLA、PLGA、PCL），具有良好的释药效能和成骨性能的同时兼具良好的生物安全性[9-10]。证实使用多种复合材料并搭载合理浓度的药物制备的生物材料是安全可行的。

本研究在制作单载抗结核药物复合人工骨的基础上，通过工艺的改进并引进静电纺丝技术，研制出搭载3种抗结核药物的新型人工骨复合物β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA，具有较大的表面孔径，呈多孔形态，孔隙率较大，微孔分布均匀，孔径内部光滑，内部附着载药纳米纺丝纤维与多孔间连接，结构稳定。静电纺丝工艺是通过静电力的作用来合成纤维。其制备的纳米纤维能够模仿组织器官的细胞外基质的结构尺寸。纤维支架具有相互连接的空隙的多孔结构和优越的比表面，利于细胞的黏附及生长。可将不同聚合物的共混，并且加入无机材料等添加物制各成复合纤维以适应不同需求[11]。使用静电纺丝法工艺，可以很方便对搭载药物的载体进行塑形，同时载药膜具备较大的接触面积易于药物搭载和释放。利用静电纺丝技术制作的组织工程支架、载药载体等均证实具有良好的生物相容性及安全性[12-14]。其载药量在局部能实现长达3个月有效缓释，局部药物缓释浓度能达到每种药品的最低杀菌浓度。该材料主要成分在既往实验中虽已获得生物安全性认可，但复合后并搭载3种抗结核药物研制成的新型复合材料，其安全性如何，是否对人体具有毒性、致癌致病性、致畸性或其他潜在危害，仍是必须关注的问题。同时一种医用材料在正式投入生物体研究或临床应用前，必须依照国家有关标准[15-16]，对其进行生物安全性评价。

对生物材料的生物安全性评价方法主要有两类[17]：动物体内实验和体外实验。前者是将材料植入实验动物体内后，观察材料及周围组织病理变化，评价组织相容性。后者是用材料或材料浸提液，在动物体外进行一系列研究，测试材料对组织细胞增殖、生长、分化等活动的影响，以MTT细胞毒性实验为代表[18]。这一方法被广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测，目前己成为生物材料和医疗器械生物评价体系中最重要的指标之一。其在分析生物材料是否具有毒性和对细胞的影响方面比体内实验具有更高的敏感性。本实验材料β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA复合体最终需要在体内长期内置，因此根据国家制定医用材料生物安全性评价要求，选用致敏实验、原发性皮肤刺激实验、皮内刺激实验和急性全身毒性实验评价本材料的生物安全性。

本实验结果显示新型人工骨复合物β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA材料在MTT实验中7 d内细胞存活率>95%，较空白对照组稍低，但明显高于RFP直接给药阳性对照组<85%，说明本实验材料具有良好细胞相容性，无明显的细胞毒性。材料组中抗结核药物载量远高于直接给药组，而细胞存活率却较高，说明抗结核药物在复合入生物材料并制备成缓释形态后，能够降低抗结核药物直接给药所产生的毒性。致敏实验、原发性皮肤刺激实验、皮内刺激实验、急性全身毒性实验等体内实验结果表明本实验材料无毒，无致敏性。因此，阶梯缓释抗结核药物纳米人工骨复合材料（β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA）具有良好的生物相容性和安全性，能够投入到进一步的生物体实验研究中。

[参考文献]

[1]LeGeros RZ. Biodegradation and bioresorption of calcium phosphate ceramics [J].Clin Mater，1993，14（1）：65-88.

[2]胡红涛.孔壁表现纳米化的nHA晶须增强多孔骨支架的制备与性能研究[D].上海：第二军医大学，2012.

[3]张智星.控释性可注射牙槽骨修复材料的生物学性能研究[D].武汉：华中科技大学，2009.

[4]郭洪刚，刘静，李峰坦，等.新型纳米化仿生骨基质与羊脂肪基质细胞复合培养的生物相容性[J].中国组织工程研究，2012，16（16）：2889-2892.

[5]王昊，周志平，戴晓晖，等.温敏性聚己内酯-聚N-异丙基丙烯酰胺作为抗癌药物载体的制备与药物释放的研究[J].功能材料，2013，44（3）：435-441.

[6]王永生.VEGF-BSA/PCL-PEG同轴纳米纤维缓释载体的构建及体外血液相容性和生物学活性的研究[D].武汉：华中科技大学，2012.

[7]Tseng H，Puperi DS，Kim EJ，et al. Anisotropic poly（ethylene glycol）/polycaprolactone （PEG/PCL） hydrogel-fiber composites for heart valve tissue engineering [J]. Tissue Eng Part A，2014，8：10.

[8]石拯拯，李海斌，曹建霞，等.利福平海藻酸钠微球栓塞剂的制备及体外释药研究[J].实用医学杂志，2013，29（11）：1727-1730.

[9]席焱海，薛敏涛，叶晓健，等.交联可调式抗结核药物缓释型纳米人工骨体内成骨的观察[J].中华医学杂志，2013， 93（19）：1494-1498.

[10]席焱海，薛敏涛，叶晓健，等.交联可调式抗结核药物缓释型纳米人工骨复合体的生物安全性研究[J].脊柱外科杂志，2012，10（4）：247-250.

[11]Zhang YZ， OUYang HW， Chwee TL，et al. Electrospinning of gelatin fibers and gelatin/PCL composite fibrous scaffolds [J]. Wiley Inter Science，2004，（72）：156-165.

[12]马骁.静电纺丝制备PLGA三维组织工程支架的研究[D].大连：大连医科大学，2013.

[13]何莉，王立新，张幼珠，等.载药聚乳酸纤维膜的制备及释药性能研究[J].合成纤维，2007，36（9）：19-21，25.

[14]赵俊成.负载凝血酶可溶性鸡蛋壳膜蛋白-聚丁二酸丁二醇酯共同静电纺丝止血材料的研究[D].北京：解放军军医进修学院，2013.

[15]国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.医用有机硅材料生物学评价试验方法[S].北京：中国标准出版社，GB/T 16175-2008.

[16]国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.医疗器械生物学评价——第1部分：风险管理过程中的评价与试验[S].北京：中国标准出版社，GB/T 16886.1-2011.

[17]张真，卢晓风，李幼平，等.生物材料有效性和安全性评价的现状与趋势[J].生物医学工程学杂志，2002，19（1）：117-121.

[18]Srivastava S，Gorham SD，Courtney JM. Screening of in vitro cytotoxicity by the adhesive test [J]. Biomaterials，1990， 11（2）：133-137.

（收稿日期：2014-03-16本文编辑：卫轲）