缺氧诱导因子2α在宫颈鳞癌组织中的表达及其意义

周红艳　郭艳风

【摘要】 目的：探讨缺氧诱导因子2α（HIF-2α）在宫颈鳞癌组织中的表达及其意义。方法：通过原位杂交（ISH）技术检测102例宫颈鳞癌组织、66例CIN组织和40例正常宫颈组织中HIF-2α mRNA的表达情况及其与宫颈鳞癌临床病理参数的关系。结果：HIF-2α mRNA在宫颈鳞癌组织中的阳性表达率均显著高于正常宫颈组织和CIN组织（P<0.05），并且HIF-2α mRNA在宫颈鳞癌组织中的阳性表达与淋巴结转移（字2=6.766，P=0.009）和临床分期（字2=11.639，P=0.001）相关，而与年龄、病理组织学分化程度、浸润深度无关（P>0.05）。结论：HIF-2α mRNA在宫颈鳞癌组织中表达上调，可能与宫颈鳞癌的发生和演进有关。

【关键词】 缺氧诱导因子2α； 宫颈鳞癌； 原位杂交

在全球范围内，宫颈癌是女性第3大常见恶性肿瘤，严重威胁着妇女的健康和生命[1]。宫颈鳞癌是宫颈癌最常见的病理类型，本研究通过原位杂交（in situ hybridization，ISH）技术检测宫颈鳞癌组织、CIN组织和正常宫颈组织中缺氧诱导因子2α（hypoxia-inducible factor 2α，HIF-2α）mRNA的表达情况及其与宫颈鳞癌临床病理参数的关系，旨在探讨HIF-2α在宫颈鳞癌发生与演进中的作用。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集2006年3月-2012年3月在本院住院患者的宫颈组织蜡块208例，术前患者均未接受放疗及化疗。患者年龄在34～65岁，平均（45.8±3.5）岁。其中包括宫颈鳞癌102例、CIN组66例、正常宫颈组织40例。

1.2 临床病理资料 宫颈组织蜡块共208例，术前患者均未接受放疗及化疗。（1）宫颈鳞癌组：102例，术前均经宫颈活组织病理证实。其中浅肌层浸润癌42例，深肌层及以上浸润癌60例；伴淋巴结转移的18例；术后病理组织学分级（按照WHO分类标准进行组织学分级）：其中高分化32例，中分化44例、低分化26例；临床分期，Ⅰ期56例，Ⅱ期21例，Ⅲ期17例，Ⅳ期8例；（2）CIN组：66例，其中CIN-Ⅰ级12例，CIN-Ⅱ级24例，CIN-Ⅲ级30例；（3）正常宫颈组织组：同期住院因子宫良性疾病行子宫全切术，术后病理证实宫颈正常者40例。

1.3 主要试剂及试剂盒 DAB显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司，人原位杂交检测试剂盒（MK2210h）购自武汉博士德生物工程有限公司，5端地高辛标记的HIF-2α寡核苷酸探针序列：5-GAAGC TGACC AGCAG ATGGA CAACT TGTAC CTGAA-3，由武汉博士德生物工程有限公司合成。

1.4 ISH染色 石蜡切片经新鲜配置的二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水后，用新鲜配制的3% H2O2室温处理5～10 min，以灭活内源性过氧化物酶，切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，37 ℃消化20 min，消化标本DNA结合蛋白，1%多聚甲醛/0.1 M PBS（pH7.2～7.6），室温固定10 min，每张切片加20 μL不含探针的预杂交液，恒温箱40 ℃ 4 h，每张切片加20 μL含探针的杂交液，恒温箱40 ℃杂交过夜，杂交后洗涤，滴加封闭液，滴加生物素化鼠抗地高辛，滴加SABC，滴加生物素化过氧化物酶，PBS清洗，DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.5 ISH结果判定 HIF-2α阳性信号为棕黄色颗粒，定位于细胞质；参照文献[2]，原位杂交的阳性计算方法为：于高倍镜下（×400）随即选取10个视野（每个视野观察细胞数不少于100个），阳性细胞数<30%、30%～70%、>70%分别记1、2、3分。阳性着色强度：杂交信号强度可分为弱（+）、中（++）、强（+++）三级，分别记1、2、3分：1分为弱阳性（+）：细胞质内可见浅黄色颗粒，明显高于背景底色。2分为阳性（++）：细胞质内见黄色颗粒。3分为强阳性（+++）：细胞质内有大量棕黄色颗粒。上述2种记分相乘，<2分者为阴性，≥2分者为阳性。

1.6 统计学处理 应用SPSS 16.0统计学软件对数据进行处理，两样本率的比较采用四格表资料的 字2检验，多样本率的比较采用行列表资料的 字2检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常宫颈、CIN及宫颈鳞癌组织中HIF-2α mRNA的表达 HIF-2α mRNA在正常宫颈组织、CIN和宫颈鳞癌组织中阳性率分别为0、22.7%（15/66）、68.6%（70/102），三组比较差异有统计学意义（ 字2=68.005，P<0.05），且两两比较差异有统计学意义（P<0.05）。HIF-2α mRNA在正常宫颈、CIN和宫颈鳞癌组织中的表达见图1～图3。

2.2 HIF-2α mRNA的阳性表达与宫颈鳞癌临床病理特征的关系 伴淋巴结转移的宫颈鳞癌组织中HIF-2αmRNA的阳性表达率较高（P<0.05）；宫颈鳞癌的临床分期越晚，HIF-2αmRNA的阳性表达率越高（P<0.05）。HIF-2α mRNA在宫颈鳞癌组织中的阳性表达率与年龄、病理组织学分化程度和浸润深度无关（P>0.05），见表1。

3 讨论

HIF是广泛存在于人和哺乳动物体内的一种转录因子，目前发现的缺氧诱导因子成员有HIF-1、HIF-2、HIF-3 3种。HIF-2是由HIF-2α和HIF-1β两个亚基构成的异源二聚体蛋白质复合物，HIF-2α和HIF-1β均为碱性螺旋-环-螺旋-PAS（bHLH-PAS）转录因子超家族成员。

研究已证实，HIF-2α在多种恶性肿瘤中高表达，如结直肠癌、胃癌、非小细胞肺癌、膀胱移行细胞癌、肾细胞癌、乳腺癌、口腔鳞状细胞癌等，由此推测HIF-2α可能为一个癌基因[3-9]。本研究显示，正常宫颈组织中与CIN组织中HIF-2α mRNA的阳性表达率两组比较差异均有统计学意义（P<0.05），CIN组织中与宫颈鳞癌组织中HIF-2α mRNA阳性表达率两组比较差异均有统计学意义（P<0.05），说明HIF-2α的表达可能在宫颈鳞癌的发生、发展过程中起着重要作用。Mandriota等[10]研究发现，在肾透明细胞癌中检测到较高的HIF-2α表达，并且表达的增加与进展期肿瘤的损害程度有关。Turner等[11]在研究HIF-2α与肾癌血管化和VHL基因突变的关系中发现，17例透明细胞癌中有11例HIF-2α mRNA表达水平增高，与相应的正常组织相比有显著差异，以上结果均表明HIF-2α表达的增高与肾透明细胞癌有显著相关性，与本研究结果相似。endprint

此外，本研究还分析了HIF-2α mRNA的表达与患者临床分期、淋巴结转移、分化程度等主要临床病理学特征间的关系，结果显示 HIF-2α mRNA的表达与淋巴结转移和临床分期相关（P<0.05），而与年龄、病理组织学分化程度、浸润深度无关（P>0.05），由这一结果进一步推测HIF-2α的高表达可能与宫颈鳞癌的发生、发展密切相关。用RNAi技术干扰乳腺癌细胞中HIF-2α的表达后，癌细胞凋亡显著增多[12]。Liu等[13]用RNAi技术干扰NSCLC（非小细胞肺癌）癌细胞中HIF-2α的表达，可以明显抑制癌细胞的侵袭、粘附和转移，推测可能跟HIF-2α上调趋化因子受体4的表达有关。在乳腺癌中，HIF-2α高表达与肿瘤大小、远处转移及不良预后有关，HIF-2α表达越高，越易发生远处转移，且HIF-2α表达与MMP-2的表达正相关[14]。Petrella等[15]在转移性肾癌中发现HIF-2α可以诱导MT1-MMP的表达。MMP有明显的促肿瘤侵袭转移的作用，因此HIF-2α有增强肿瘤细胞侵袭和转移的作用。在甲状腺乳头状癌中，HIF-2α表达与淋巴结转移相关，而与年龄、肿瘤大小、TNM分期无关[16]。此结果与上述研究结果相似，提示HIF-2α可能在宫颈鳞癌的发生、发展过程中起着重要的作用，参与了宫颈癌的侵袭、转移等过程，并可能成为宫颈鳞癌一个新的分子治疗靶点。

综上所述，HIF-2α的高表达可能与宫颈鳞癌的发生和演进存在密切的关系；检测HIF-2α的表达水平，可对宫颈鳞癌进行早期诊断和治疗观察，但其在宫颈鳞癌中的作用尚需进一步探讨，这对完善宫颈癌的致癌机制及指导治疗具有重要意义。

参考文献

[1] Jemal A，Bray F，Center M M，et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.

[2]王伯沄，李玉松，黄高昇，等.病理学技术[M].北京：人民卫生出版社，2000：354-366，565-596.

[3] Xue X，Taylor M，Anderson E，et al.Hypoxia-inducible factor-2alpha activation promotes colorectal cancer progression by dysregulating iron homeostasis[J].Cancer Res，2012，72（9）：2285-2293.

[4] Wang Y，Li Z，Zhang H，et al.HIF-1alpha and HIF-2alpha correlate with migration and invasion in gastric cancer[J].Cancer Biol Ther，2010，10（4）：376-382.

[5] Wu X H，Qian C，Yuan K.Correlations of hypoxia-inducible factor-1alpha/hypoxia-inducible factor-2alpha expression with angiogenesis factors expression and prognosis in non-small cell lung cancer[J].Chin Med J （Engl），2011，124（1）：11-18.

[6] Onita T，Ji P G，Xuan J W，et al.Hypoxia-induced， perinecrotic expression of endothelial Per-ARNT-Sim domain protein-1/hypoxi-a-inducible factor-2alpha correlates with tumor progression， vascularization， and focal macrophage infiltration in bladder cancer[J].Clin Cancer Res，2002，8（2）：471-480.

[7] Wright T M，Rathmell W K.Identification of Ror2 as a hypoxia-inducible factor target in von Hippel-Lindau-associated renal cell carcinoma[J].J Biol Chem，2010，285（17）：12 916-12 924.

[8] Giatromanolaki A，Sivridis E，Fiska A，et al.Hypoxia-inducible factor-2 alpha （HIF-2 alpha） induces angiogenesis in breast carcinomas[J].Appl Immunohistochem Mol Morphol，2006，14（1）：78-82.

[9] Zhu G Q，Tang Y L，Li L，et al.Hypoxia inducible factor 1alpha and hypoxia inducible factor 2alpha play distinct and functionally overlapping roles in oral squamous cell carcinoma[J].Clin Cancer Res，2010，16（19）：4732-4741.

[10] Mandriota S J，Turner K J，Davies D R，et al.HIF activation identifies early lesions in VHL kidneys： evidence for site specific tumor suppressor function in the nephron[J].Cancer Cell，2002，1（2）：459-468.endprint

[11] Turner K J，Moore J W，Jones A，et al.Expression of hypoxia-inducible factors in human renal cancer： relationship to angiogenesis and to the von Hippel Lindau gene mutation[J].Cancer Res，2002，62（12）：2957-2961.

[12] Kim R J，Park J R，Roh K J，et al.High aldehyde dehydrogenase activity enhances stem cell features in breast cancer cells by activating hypoxia-inducible factor-2alpha[J].Cancer Lett，2013，333（1）：18-31.

[13] Liu Y L，Yu J M，Song X R，et al.Regulation of the chemokine receptor CXCR4 and metastasis by hypoxia-inducible factor in non small cell lung cancer cell lines[J].Cancer Biol Ther，2006，5（10）：1320-1326.

[14] Wang H X，Qin C，Han F Y，et al.HIF-2alpha as a prognostic marker for breast cancer progression and patient survival[J].Genet Mol Res，2014，24（13）：45-48.

[15] Petrella B L，Lohi J，Brinckerhoff C E.Identification of membrane type-1 matrix metalloproteinase as a target of hypoxia-inducible factor-2 alpha in von Hippel-Lindau renal cell carcinoma[J].On-cogene，2005，24（6）：1043-1052.

[16] Wang N，Luo H J，Yin G B，et al.Overexpression of HIF-2alpha， TWIST， and CXCR4 is associated with lymph node metastasis in papillary thyroid carcinoma[J].Clin Dev Immunol，2013，2013：589 423.

（收稿日期：2014-05-19） （本文编辑：蔡元元）endprint

[11] Turner K J，Moore J W，Jones A，et al.Expression of hypoxia-inducible factors in human renal cancer： relationship to angiogenesis and to the von Hippel Lindau gene mutation[J].Cancer Res，2002，62（12）：2957-2961.

[12] Kim R J，Park J R，Roh K J，et al.High aldehyde dehydrogenase activity enhances stem cell features in breast cancer cells by activating hypoxia-inducible factor-2alpha[J].Cancer Lett，2013，333（1）：18-31.

[13] Liu Y L，Yu J M，Song X R，et al.Regulation of the chemokine receptor CXCR4 and metastasis by hypoxia-inducible factor in non small cell lung cancer cell lines[J].Cancer Biol Ther，2006，5（10）：1320-1326.

[14] Wang H X，Qin C，Han F Y，et al.HIF-2alpha as a prognostic marker for breast cancer progression and patient survival[J].Genet Mol Res，2014，24（13）：45-48.

[15] Petrella B L，Lohi J，Brinckerhoff C E.Identification of membrane type-1 matrix metalloproteinase as a target of hypoxia-inducible factor-2 alpha in von Hippel-Lindau renal cell carcinoma[J].On-cogene，2005，24（6）：1043-1052.

[16] Wang N，Luo H J，Yin G B，et al.Overexpression of HIF-2alpha， TWIST， and CXCR4 is associated with lymph node metastasis in papillary thyroid carcinoma[J].Clin Dev Immunol，2013，2013：589 423.

（收稿日期：2014-05-19） （本文编辑：蔡元元）endprint

[11] Turner K J，Moore J W，Jones A，et al.Expression of hypoxia-inducible factors in human renal cancer： relationship to angiogenesis and to the von Hippel Lindau gene mutation[J].Cancer Res，2002，62（12）：2957-2961.

[12] Kim R J，Park J R，Roh K J，et al.High aldehyde dehydrogenase activity enhances stem cell features in breast cancer cells by activating hypoxia-inducible factor-2alpha[J].Cancer Lett，2013，333（1）：18-31.

[13] Liu Y L，Yu J M，Song X R，et al.Regulation of the chemokine receptor CXCR4 and metastasis by hypoxia-inducible factor in non small cell lung cancer cell lines[J].Cancer Biol Ther，2006，5（10）：1320-1326.

[14] Wang H X，Qin C，Han F Y，et al.HIF-2alpha as a prognostic marker for breast cancer progression and patient survival[J].Genet Mol Res，2014，24（13）：45-48.

[15] Petrella B L，Lohi J，Brinckerhoff C E.Identification of membrane type-1 matrix metalloproteinase as a target of hypoxia-inducible factor-2 alpha in von Hippel-Lindau renal cell carcinoma[J].On-cogene，2005，24（6）：1043-1052.

[16] Wang N，Luo H J，Yin G B，et al.Overexpression of HIF-2alpha， TWIST， and CXCR4 is associated with lymph node metastasis in papillary thyroid carcinoma[J].Clin Dev Immunol，2013，2013：589 423.

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