高效液相色谱法测定六味地黄胶囊中熊果酸含量

孙桂梅，钟秀华，马 杰

(修正药业集团股份有限公司，吉林 通化 134000)

六味地黄胶囊由熟地黄、酒萸肉、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻6味药材组方，具有滋阴补肾的功效，用于治肾阴亏损、头晕耳鸣、腰膝酸软、骨蒸潮热、盗汗遗精、消渴等症，收载于2010年版《中国药典(一部)》[1]，原标准中采用双波长薄层扫描法检测熊果酸的含量，操作较复杂，不及高效液相色谱(HPLC)法重现性和准确度好。为了更有效地控制该制剂的质量，笔者采用HPLC法测定六味地黄胶囊中熊果酸的含量，现报道如下。

1 仪器与试药

EX1600型自动进样高效液相色谱仪;FA2004B型电子天平。熊果酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号为110742-200517，供含量测定用);六味地黄胶囊(修正药业集团有限公司);乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为纯净水。

2 方法与结果

2．1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Phenomenex C18柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm);流动相:乙腈 - 甲醇 -0．5%醋酸铵溶液(67 ∶12 ∶21);流速:1．0 mL/min;柱温:30℃;检测波长:210 nm;进样量:20 μL。在此条件下，理论板数按熊果酸峰计算应不低于5 000，熊果酸与杂质峰的分离度大于1．5，峰形良好，阴性对照品无干扰，色谱图见图1。

2．2 溶液制备

取熊果酸对照品适量，精密称定，加乙醇制成每1 mL含熊果酸0．12 mg的溶液，即得对照品溶液。取装量差异项下的本品内容物适量，研细，混匀，取细粉约1．5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇25 mL，称定质量，超声处理(功率250 W，频率50 kHz)30 min，放冷，再称定质量，加乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按处方比例及工艺制备不含酒萸肉阴性样品，按供试品溶液制备方法制得阴性对照品溶液。

2．3 方法学考察

图1 高效液相色谱图

线性关系考察:分别精密量取 0，1，2，3，4，5 mL 熊果酸对照品溶液(0．260 2 g/L)，置5 mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，分别定量注入液相色谱仪20 μL，记录峰面积，以进样量(X)为横坐标、峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线，得回归方程Y=269．27 X+18．872，r=0．999 9(n=6)。结果表明，熊果酸进样量在1．041～5．204 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

精密度试验:取同一对照品溶液，连续进样6次，依法测定。结果峰面积的 RSD为0．81%(n=6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液，放置 1，2，4，6，8 h后进样，测定峰面积。结果的 RSD为0．69%(n=5)，表明供试品溶液在8 h内稳定。

重复性试验:取同一批样品(批号为121201)，依法制备供试品溶液并进样测定6次。结果的 RSD为0．64%(n=6)，表明方法重复性良好。

加样回收试验:分别精密称取已知含量(熊果酸含量0．642 7 mg/0．3 g)的六味地黄胶囊样品细粉6份，每份约0．75 g，平均分成3组，分别精密加入熊果酸对照品溶液，按样品处理方法处理，进样测定，记录峰面积，并计算回收率。结果见表1。

2．4 样品含量测定[2]

依法测定3批样品的熊果酸含量。结果批号为 121103，121104，121201的3批样品中熊果酸含量分别为每粒 0．75，0．72，0．64 mg。

3 讨论

比较了2种不同的流动相条件，结果用甲醇-0．4%磷酸溶液(15∶85)作流动相时，熊果酸与齐墩果酸的出峰时间比较靠前，且基线不易平衡。采用乙腈-甲醇-0．5%醋酸铵溶液(67∶12∶21)为流动相，前分离度在 1．5以上，后分离度在 3．0以上，理论板数在17 000以上，因此选用乙腈-甲醇-0．5%醋酸铵溶液(67∶12∶21)作为熊果酸含量测定的流动相。

表1 熊果酸加样回收试验结果(n=6)

[1]国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)[M]．北京:中国医药科技出版社，2010:190，600，附录 130-131．

[2]金德庄，张 聪．不同产地山茱萸中熊果酸与齐墩果酸含量的研究[J]．中国药业，2010，19(14):35．