大鼠肌肉挫伤组织中SLC1A1mRNA表达与损伤时间的关系

杜秋香，宋丽娟，张凌宇，李三强，王亚芳，孙俊红，王英元*

(1山西医科大学法医学院，太原 030001;2山西省太原市公安局杏花岭分局;*通讯作者，E-mail:wyy580218@163.com)

转运蛋白是定位在细胞质膜和细胞器膜上的、能转运糖、氨基酸、无机盐离子和药物等重要成分进出细胞的跨膜蛋白的总称。细胞中主要的转运蛋白有离子通道(ion channel)、ABC转运蛋白、水通道(aquaporin)、钠/钾离子泵、溶质转运蛋白(solute carrier，SLC)等［1］。溶质转运蛋白(SLC)是细胞内最大的一类转运蛋白，也是细胞膜上仅次于G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor，GPCR)超家族的第二大类细胞膜蛋白。He等［2］认为SLC超家族分为55个家族，包含至少362个成员。SLC1A1是溶质转运蛋白第一家族的第一位成员，也叫做兴奋性氨基酸转运体3(excitatory amino acid transporter 3，EAAT3)或者 EAAC1(excitatory amino acid carrier 1)［3］。在前期的研究中通过对肌肉损伤后4 h和8 h与正常对照组肌肉的mRNA差异表达研究发现，SLC1A1 mRNA在损伤后存在表达差异。因此，本实验通过建立不同损伤时间大鼠骨骼肌损伤动物模型，采用real-time PCR方法以Rpl13 mRNA作为内参基因［4］，测定损伤后肌肉组织中 SLC1A1 mRNA相对表达量变化，研究其与损伤时间的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

78只健康成年SD大鼠(体重250－300 g)，随机分为正常对照组和肌肉损伤 4，8，12，16，20，24，28，32，36，40，44，48 h 组，每组6 只。

1.2 肌肉损伤模型制备

3%戊巴比妥钠腹腔注射(0.13 ml/100 g体重)麻醉:①将损伤组大鼠置于自制固定装置，使250 g重力锤从150 cm高度自由落下，造成大鼠右后肢股四头肌处肌肉挫伤后，按分组分别于挫伤后4 h，8 h，12 h，16 h，20 h，24 h，28 h，32 h，36 h，40 h，44 h，48 h将大鼠颈椎脱臼处死，并快速于挫伤处取50 mg肌肉组织置于液氮中保存备用;②对照组大鼠直接颈椎脱臼处死，取与损伤组大鼠相同部位肌肉组织保存备用。

1.3 RNA提取与反转录

总RNA提取严格按Promega公司SV Total RNA Isolation System(SV总RNA纯化系统)试剂盒操作说明书进行，并用Agilent公司2100生物分析仪对总RNA进行完整性检测及浓度测定。反转录反应使用 TAKARA公司 Prime Script RT-PCR Kit，10μl反转录体系内总RNA含量为0.4μg，反应液配制和反应条件按试剂盒要求操作。完成后－20℃保存。

1.4 实时定量PCR扩增反应体系及程序

PCR扩增在Stratagene公司Mx3000P实时荧光定量PCR仪上进行，PCR反应液购买于TAKARA公司的Premix Ex Taq(Probe qPCR)。对照组和不同损伤时间组cDNA样本各取2.0μl加入25.0μl的反应体系。反应条件:95℃预变性10 s，1个循环;第二阶段:95℃，5 s，60 ℃，20 s，终点采集荧光信号，共40个循环。对内参基因Rpl13 mRNA和目的基因SLC1A1 mRNA进行同时扩增，并以Rpl13 mRNA的表达量进行各组间SLC1A1 mRNA表达量的均一化处理，由Stratagene MxPro QPCR软件自动输出相对差异表达量。

SLC1A1和Rpl13的cDNA序列子Genebank下载后采用AlleleID 6.0软件进行引物设计，并经NCBI上BLAST比对后用于real－time PCR检测。引物信息见表1，所有引物均由Invitrogen公司合成。

表1 实时荧光定量PCR引物和探针Table 1 Sequences of PCR primer and probe

1.5 标准曲线

为测定SLC1A1 mRNA与内参基因Rpl13 mRNA的扩增效率，cDNA溶液按10倍梯度稀释，再将相当于0.01，0.1，1.0，10，100 ng 总 RNA 量的 cDNA作为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，由Stratagene MxPro QPCR软件自动分析并输出标准曲线。

1.6 数据统计与分析

实时定量PCR结果由荧光定量分析仪自动采集给出目的基因和内参基因的Ct值，基因表达量采用实验组/对照组=2－ΔΔCt进行计算，其中 ΔΔCt=ΔCt实验－ΔCt对照。由于每组中目的基因和内参基因加入的量是一致的，所以可以对每个样本ΔCt值(=Ct目的－Ct内参)采用 SPSS10.0 统计软件进行组间比较后再进行2－ΔΔCt计算表达量。

2 结果

2.1 总RNA完整性检测及定量

采用Agilent2100生物分析仪进行的总RNA检测，其横坐标表示保留时间，纵坐标表示荧光强度。本实验提取的总RNA，其完整性指数(RNA integrity number，RIN)=8.6(图1，见第341 页)，在28S 峰值后再没有其他杂带峰出现，说明没有基因组DNA的污染，其中总 RNA 浓度为 58 ng/μl，18S∶28S=1.1。

2.2 相对定量的标准曲线

将相当于0.01－100 ng总RNA量的cDNA作为模板，进行实时定量PCR扩增，制作标准曲线(图2)。从图2可知，SLC1A1和Rlp13的标准曲线和两者的扩增效率基本一致。

图1 Agilent 2100生物分析仪检测总RNA的完整性及浓度Figure 1 Total RNA integrality and density by Agilent 2100 bioanalyzer

图2 SLC1A1与Rlp13的标准曲线Figure 2 The standard curve of SLC1A1 and Rlp13

2.3 SLC1A1 mRNA在大鼠肌肉组织挫伤后不同时间点相对表达

肌肉组织挫伤后SLC1A1 mRNA表达量变化幅度非常大，损伤后4 h即有所升高，8 h达到峰值，最高为正常对照组的19倍，随着损伤后时间延长，其表达量逐渐回落，但是在24 h以内依然是对照组的11倍以上(见图3)。24h以后，SLC1A1 mRNA表达急剧降低，直至48h降低为接近正常对照组水平。这一结果与筛选差异表达基因的结果相一致。

图3 肌肉损伤后不同时间点SLC1A1 mRNA相对表达量Figure 3 The relative expression of SLC1A1 mRNA in contused skeletal muscle of rat at different time

3 讨论

目前国内外对于损伤时间的研究主要集中在脑损伤和皮肤切创伤。通过对胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、S100、iNOS等蛋白及 slit2 mRNA的研究［5］，发现这些因子在脑损伤后随时间呈现一定的变化规律。通过对皮肤损伤局部组织中p38MAPK、JNK、calpain、caspases、NOS、纤维连接蛋白、IL－1α、IL－1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF－α)细胞间黏附分子1(ICAM－1)、ICAM－2、、核转录因子(NF－κB)、P 选择素、Beclin1、LC3 等诸多细胞因子［6－8］进行研究，发现这些细胞因子在皮肤切创后有不同程度的表达，而且随着损伤时间的延长，呈现一定的时间相关性，为法医病理学推断损伤时间提供了一些客观的依据。但对于在损伤类型中占绝大多数，且经常伴随其他损伤方式存在的肌肉挫伤仅有少量的报道。本实验通过建立大鼠肌肉挫伤模型，应用实时定量PCR的方法研究SLC1A1 mRNA在肌肉挫伤后的表达规律。

氨基酸是机体内重要的小分子极性物质，不能自由通过细胞膜，需要细胞膜上相应转运蛋白的协助才能完成转运。根据转运载体的底物特异性和动力学特性，目前已经确定的氨基酸转运系统有15种以上。其中酸性氨基酸转运载体的X－AG系统的转运蛋白主要有 5种，分别为 EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4、EAAT5［9］。这类转运系统虽然主要在脑部组织中存在，但是SLC1A1(EAAC1，EAAT3)与其他兴奋性氨基酸载体不同，它不是神经特异性，SLC1A1在多种组织中都有发现，比如胃、肝脏、肾、胰腺［10］，而且在体内各器官分布也较均一。SLC1A1首先是一种高亲和力的谷氨酸转运载体，在保持细胞外谷氨酸浓度，防止兴奋过度和兴奋性中毒方面起关键作用［11］，而且SLC1A1可以通过神经系统广泛表达并作用于非神经组织中，本实验结果证实:在正常大鼠骨骼肌中有一定数量的SLC1A1 mRNA表达，挫伤后4 h SLC1A1 mRNA的表达开始上升，8 h达高峰，直至24 h内一直处于表达的高位，之后逐渐回落至48 h接近正常对照组，这可能是由于骨骼肌损伤后，作为机体重要能量来源的必需氨基酸—谷氨酸及其他氨基酸在损伤局部的大量释放，刺激SLC1A1的表达升高至损伤愈合的最初24 h内。类似的结果在老年痴呆症患者的脑组织［12］与急性脑缺血损伤大鼠神经元［13］等其他神经系统疾病中均有出现，但是肌肉组织中的表达尚未见报道，本次实验不仅对推断肌肉挫伤时间提供了一个可能的指标，同样为肌肉组织中SLC1A1(EAAC1，EAAT3)的表达提供了实验依据。

此外，以上研究结果提示，实时定量PCR具有高度的灵敏性、准确的定量性以及良好的重复性，通过该法检查SLC1A1 mRNA的变化情况，并结合其他形态学的变化，对于损伤时间的推断有一定的帮助作用。

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