田蓟苷微乳在大鼠小肠吸收特性的研究

李 伟，袁 勇，邢建国，王立萍，陈卫军，王新春，

(1.石河子大学药学院，新疆石河子 832002;2.石河子大学医学院第一附属医院，新疆石河子 832008;3.新疆自治区药物研究所，新疆 乌鲁木齐 830004)

香青兰(Dracocephalum moldevicaL.)为唇形科青兰属植物，具有治疗高血压、高血脂、心绞痛和冠心病作用，田蓟苷(Tilianin)是其主要活性成分［1－2］。因其水溶性差，口服给药吸收不理想［3］。为增加田蓟苷溶解度，课题组前期进行了微乳制备工艺的研究［4］。在此基础上，依据大鼠与人小肠生理状况相似的特点［5］，采用大鼠在体单向灌流模型和外翻肠囊模型考察田蓟苷肠灌流液、田蓟苷微乳在大鼠各肠段吸收行为及其在小肠的吸收机制，探讨微乳载体对田蓟苷口服吸收的影响，为田蓟苷新型给药系统的口服制剂的设计提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent-1100高效液相色谱仪(安捷伦公司);T01-100蠕动泵驱动器(保定兰格恒流泵有限公司);TG16B型台式高速离心机(长沙凯达科学仪器有限公司);AR-1140电子分析天平(奥豪斯国际贸易有限公司)。

1.2 试剂与试药 田蓟苷对照品、单体(纯度＞98%、90%，自制);聚氧乙烯氢化蓖麻油(RH-40，BASF公司);油酸(OA，天津市光复精细化工研究所);无水乙醇(天津永晟精细化工有限公司);乙腈(色谱纯，SK Chemicals公司);乌拉坦(上海行知化工厂);PBS(pH 6.8);其他试剂为分析纯。1.3 动物 SD大鼠(♀♂各半)，180～220 g，清洁 Ⅱ 级，购自新疆医科大学实验动物中心。合格证号:新医动字第2003－0001号。

2 方法

2.1 HPLC测定田蓟苷含量

2.1.1 色谱条件 色谱柱:Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相:乙腈 － 水(35 ∶65)，流速:1.0 ml·min－1;柱温:25℃;PDA检测器，检测波长:325 nm;进样量:20 μl。

2.1.2 供试液配制 田蓟苷储备液:精密称定田蓟苷对照品，1∶1乙腈－水溶解。田蓟苷肠灌流液:大鼠在体肠灌流液加田蓟苷储备液，超声摇匀。田蓟苷微乳:处方量 OA、RH 40、乙醇和水，搅匀;加入田蓟苷单体，搅拌至溶散。

2.1.3 标准曲线 制备 5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、40.0 mg·L－1标准溶液。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，线性回归得方程=2.874X－1.338，r=0.9994，线性关系良好。

2.2 大鼠小肠对田蓟苷微乳的吸收

2.2.1 大鼠在体单向灌流模型 参照文献制备模型［6］，SD大鼠禁食12 h(自由饮水)，腹腔注射乌拉坦麻醉，开腹结扎胆管，分离十二指肠、空肠、回肠及结肠。取10 cm结扎，冲洗内容物，插管结扎，保湿。0.5 ml·min－1将 37℃ 田蓟苷肠灌流液、微乳泵入肠段充满药液，30 min调至0.25 ml·min－1，记时。每15 min更换下一个供试液和收集液小瓶，于记时后 45、60、75、90、105 min取样。剪下肠段测量长度和内径。样品加10倍乙腈，超声10 min，10 000r·min－1离心10 min，按 HPLC 2.1.1取上清液测定，考察各肠段吸收，重量分析法校正，计算各肠段Ka和 Papp。

2.2.2 大鼠外翻肠囊模型 按照文献报道进行外翻肠囊实验［7］于15、45、75 min 量取肠外田蓟苷肠灌流液、微乳。样品处理同上。计算田蓟苷吸收量、吸收百分率和Ke。

3 结果

3.1 大鼠小肠各肠吸收考察段 田蓟苷、微乳在整个肠道均有吸收;微乳Ka、Papp:回肠 ＞十二指肠 ＞空肠 ＞结肠，与田蓟苷实验趋势一致，且均高于田蓟苷;经 SPSS统计分析:回肠与结肠存在显著性差异(P＜0.05)，与田蓟苷相比差异存在显著性(P＜0.01)，见 Tab 1。

3.2 不同浓度药物吸收考察 7.0～28.0mg·L－1对Ka和Papp无明显影响(P＞0.05)，不受质量浓度影响，满足 Fick's扩散定律，均为被动扩散，Tab 2。

Tab 1 Kaand Pappof tilianin，tilianin ME at various intestine segments in rats(±s，n=6)

Tab 1 Kaand Pappof tilianin，tilianin ME at various intestine segments in rats(±s，n=6)

Intestine Tilianin Ka×10－2/min Papp×10－2/Papp×10－2/cm·min －1 Tilianin ME Ka×10－2/min cm·min －1 Duodenum 2.0948 ±0.12490.2333 ±0.0263 9.3003 ±0.5516 1.3590 ±0.1429 Jejunum 1.9061 ±0.1539 0.2111±0.0159 9.2928 ±0.5201 1.3651 ±0.0768 Ileum 2.1479 ±0.2197 0.2396±0.0398 11.4079 ±0.5425 1.6581 ±0.0750 Colon 1.8416 ±0.08410.2036±0.0114 5.7410 ±0.4520 1.1340 ±0.0485

Tab 2 Kaand Pappof tilianin，tilianin ME with various consistence at ileum in rats(±s，n=6)

Tab 2 Kaand Pappof tilianin，tilianin ME with various consistence at ileum in rats(±s，n=6)

Intestine Tilianin Ka×10－2/min Papp×10－2/Papp×10－2/cm·min －1 Tilianin ME Ka×10－2/min cm·min －1 7.0 2.0348 ±0.0578 0.2262±0.005810.5700 ±0.5262 1.5025 ±0.0634 14.0 2.0801 ±0.25390.2316±0.055412.0658 ±0.5157 1.7102 ±0.1384 28.0 2.1479 ±0.21970.2396±0.039811.4079 ±0.5425 1.6581 ±0.0750

3.3 大鼠外翻肠囊实验 以小肠内剩余药量的对数值对取样时间做线性回归，所得直线相关系数均大于0.99，初步确定田蓟苷、微乳肠道吸收均属一级动力学。微乳吸收量和吸收率比田蓟苷高出53.20%和170.35%，肠壁通透性增加112.7%，见 Tab 3。

4 讨论

实验采用在体单向灌流法和离体肠囊外翻法对田蓟苷微乳的肠吸收进行研究，并进行方法学和肠壁吸附考察，结果表明:方法学稳定、肠壁对微乳无吸附作用;微乳作为田蓟苷载体，对其小肠吸收有明显促进作用，为微乳作为田蓟苷载体可行性提供依据。

课题组前期研究发现，田蓟苷是 P-gp等外排蛋白的底物，P-gp、BCRP对其具有外排作用，肠道是主要代谢场所。本实验所用微乳含 RH 40［8］，原因可能有:(1)抑制 P-gp、MRP20等的外排;(2)抑制CYP3A酶活性和肠道菌群代谢;(3)回肠微乳吸收最好，是营养吸收主要肠段，存在大量淋巴小结，田蓟苷通过微乳载带选择性趋向集合淋巴结，经 M细胞转运吸收。且微乳表面张力低、粒径小，易于透过细胞壁，药物直接接触肠上皮细胞，从而促进吸收［9］。

Tab 3 Regression equation and Ke of tilianin ，tilianin ME with various consistence(n=6)

［1］冯长根，李 琼.香青兰化学成分研究［J］.中成药，2006，28(1):94－8.

［1］Feng C G，Li Q.Study on chemical of Dracocephalum moldavica L［J］.China Tradit Patent Med，2006，28(1):94 －8.

［2］吴 华，李景清，安文源，等.香青兰药材HPLC特征图谱的研究［J］.药物分析杂志，2009，29(7):1178－80.

［2］Wu H，Li J Q，An W Y，et al.Study on HPLC specific chromatogram of Dracocephalum moldavica L［J］.Chin J Pharm Anal，2009，29(7):1178－80.

［3］王婷婷，李 伟，袁 勇，等.大鼠单向灌流模型研究田蓟苷的在体肠吸收［J］.中国中药杂志，2013，38(7):12－5.

［3］Wang T T，Li W，Yuan Y，et al.Study on intestinal absorption of tilianin in rats of single-pass perfusion model［J］.China J Chin Mater Med，2013，38(7):12 －15.

［4］王新春，邢建国，袁 勇，等.田蓟苷微乳组合物.中国，CN102860982A［P］.2013 －04 －17.

［4］Wang X C，Xing J G，Yuan Y，et al.Tilianin Microemulsion combination.China，CN102860982A［P］.2013 －04 －17.

［5］Yuan H Zhao，Michael H，Abraham，et al.Evaluation of rat intestinal absorption data and correlation with human intestinal absorption［J］.Eur J Med Chem，2003，38(3):233 －43.

［6］Sutton C S，Rinald T S，Vukovinsky K E，et al.Comparison of the gravimetric，phenol red ，and 14C-PEG-3350Methodsto determine water adsorption in rat single-pass intestinal perfution model［J］.AAPS Pharm Sci，2001，3:25 － 32.

［7］陈宝婷，徐福平，林爱华，刘奕明.翻转肠囊法研究芒果苷在大鼠的肠吸收动力学［J］.中国药理学通报，2012，28(5):691－4.

［7］Chen B T，Xu F P，Lin A H，Liu Y M.Study on intestinal absorption of mangiferin by everted gut sacs model［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28(5):691 －4.

［8］饶子超，斯陆勤，关延彬，等.含CremophorRH40的自微乳化给药系统对大鼠体内 CYP3A酶的抑制作用［J］.医药导报，2010，29(12):1535 －9.

［8］Rao Z C，Si L Q，Guan Y B，et al.Inhibitive effect of Gremophor RH40-based self-microemulsiflying drug delivery system on cytochrome P450 3A enzymes in rats［J］.Herald Med，2010，29(12):1535－9.

［9］叶海英，张忠义，高 申，等.法莫替丁微乳的研制及其质量评价［J］.第一军医大学学报，2003，23(1):68 －70.

［9］Ye H Y，Zhang Z Y，Cao S，et al.Preparation of famotidine microemulsion and its quality evaluation［J］.J First Mil Med Univ，2003，23(1):68 －70.