超微天麻（Gastrodia elata Bl.）粉的吸收及改善睡眠功能的研究

李武，傅莉华，邝颖诗，卢倩，杨瑞丽

（广东省食品质量安全重点实验室，华南农业大学食品学院，广东广州510642）

天麻（Gastrodia elata Bl.）是兰科天麻属多年生草本植物天麻的干燥根茎，主产于我国云南、四川及贵州等地，是一种重要的药食两用植物。研究表明天麻的主要有效成分为天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛等多种成分[1]，天麻具有抗惊厥、镇静、镇痛及抗炎等生物学功能[2-3]。随着社会的发展，人们工作生活的压力越来越大，随之产生的焦虑、失眠等症状不断困扰着人们的正常生活[4-5]。在民间，作为一种重要的食材，自古就有将天麻与鸡、鱼等一同食用用于滋养安神的做法。传统的天麻加工方法是采用将鲜天麻煮或蒸后再烘干，然后切片。这种传统的加工方法有容易损失有效成分、有效成分不易浸出、质量指标难以控制等缺点，从目前的加工和食用方法来看，天麻的生物利用率还不高。超微粉碎技术是一门新兴的物料加工技术，该技术在天然食物资源开发中的应用是食品加工业的一种新尝试。超微粉碎技术在制粉技术中具有很大的优势，不仅在宏观上减小颗粒粒径，而且随着粒径细化的量变，会导致比表面积和孔隙率增加，使粉体具有良好的分散性和吸附性等，有利于营养物质的吸收[6-7]。因此，本实验旨在研究天麻超微粉在体内的吸收情况及对于改善睡眠作用的影响，为天麻微粉的制剂开发与应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物 健康雄性SD大鼠，体重220 g～250 g，购自广东省医学实验动物中心。许可证号：SCXK（粤）2008-0002；清洁级昆明种小鼠，由广州中医药大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2013-0034，等级：SPF级，饲养环境：室温为20.0℃～24.8℃，相对湿度为46.8%～50.4%RH；天麻素对照品（中国食品药品检定研究院，编号62.110807）；乙腈为HPLC级；磷酸为分析纯；无水乙醇（分析纯）；巴比妥钠、戊巴比妥钠广州健阳生物科技有限公司；天麻（Gastrodia elata Bl.）超微粉(D 5023.77 μm)由汤臣倍健股份有限公司提供，每日成人推荐服用量为2.4 g/人·d，超微粉的粒径分布图和扫描电镜照片见图 1。微粉的平均粒径 31.97 μm，D50、D90 分别为23.77 μm、51.22 μm。

由图1可看出超微粉粉体的粒径分布曲线呈正态分布，说明粉体的均匀性，分散性较好。

1.2 天麻超微粉在大鼠体内吸收情况

1.2.1 高效液相色谱条件与标准曲线绘制

利用中国药典1部等报道的HPLC法检测天麻素[8]，具体条件如下：安捷伦-C18色谱柱（4.6mm×250mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.05%磷酸溶液（3∶97）；流速为1.0 mL/min；检测波长为220 nm；柱温：25℃。精密称取天麻素标准品5 mg溶解于10 mL乙腈-0.05%磷酸溶液（3∶97），并配制成浓度为 500 μg/mL 的储备液。精密吸取储备液，分别稀释成 0.5、1、5、10、25、50 μg/mL，用孔径0.22 μm滤膜过滤后，置于样品瓶中，-20℃冰箱保存待用。按照上述色谱条件进行HPLC测定，作峰面积对浓度的标准曲线，求出直线回归方程。

图1 天麻超微粉的粒径分布图（A）和扫描电镜照片（×1000）（B）Fig.1 The size distribution（A）and scanning electron micrograph（B）of Gastrodia elata Bl.ultrafine powder

1.2.2 HPLC法测定天麻超微粉中天麻素的含量

按照张炜等[9]报道方法提取天麻素，具体方法如下：精密称取天麻超微粉0.1 g，加入10 mL水，静置过夜，次日超声30 min，3500 r/min离心10 min，取上清液于35℃减压浓缩蒸干，加流动相1 mL溶解并定容，过0.45 μm微孔滤膜后进样。

1.2.3 天麻超微粉中天麻素的生物利用度

取健康雄性SD大鼠9只，实验前禁食24 h，自由饮水。各组大鼠分别尾静脉注射天麻素（25 mg/kg）、灌胃天麻超微粉（4 g/kg）。分别于灌胃前和后5、15、30、50、70、90、120、180min 断尾取血 0.5mL，肝素抗凝，4℃、 3000 r/min离心10 min分离血浆，20℃保存备用。按照Ju XH等报道的方法进行血浆前处理[10]，精密吸取血浆150 μL，加入乙醇0.5 mL，再涡旋振荡1 min后于 12000 r/min离心10 min除蛋白，取上清液，然后在室温下氮气吹干。分别加500 μL流动相溶解，经0.22 μm微孔滤膜过滤后进样。

1.3 天麻超微粉改善睡眠功能研究

1.3.1 动物分组与处理

参照《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）中方法[11]。将健康雌性小鼠，体重 18 g～22 g，120 只，分3批用于试验，第1批动物用于直接睡眠实验和延长戊巴比妥钠睡眠时间实验，第2批动物用于戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验，第3批动物用于巴比妥钠睡眠潜伏期实验。每批动物按体重随机分为低、中、高剂量组和1个阴性对照组，每组10只动物。低、中、高剂量组分别为40、400和 1200 mg/kg·BW（分别相当于受试样品推荐日摄入量的 1、10、30倍）。按 0.2 mL/10 g·BW经口灌胃，阴性对照组给予等量溶剂，每日灌胃1次，连续30 d。

1.3.2 测定指标与方法

按照卫生部《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）方法进行。实验设3个部分：延长戊巴比妥钠睡眠时间实验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验和巴比妥钠睡眠潜伏期实验。

1.3.2.1 直接睡眠实验

观察受试组动物给予受试样品后，阴性对照组给予同体积溶剂后，是否出现睡眠现象。睡眠以翻正反射消失为指标。如超过30 s～60 s不能翻正者，既认为翻正反射消失，进入睡眠。翻正反射恢复即为觉醒，翻正反射消失至恢复这段时间为动物睡眠时间。记录对照组与受试样品组入睡动物数及睡眠时间。

1.3.2.2 延长戊巴比妥钠睡眠时间实验

在直接睡眠实验的基础上进行，如直接睡眠实验为阴性，则进行延长戊巴比妥钠睡眠时间实验。做正式实验前先进行预实验，确定使动物100%入睡，但又不使睡眠时间过长的戊巴比妥钠剂量，用此剂量做正式实验（本实验剂量为：32 mg/kg·BW）。动物末次给予溶剂及不同浓度受试样品后，出现峰作用前10 min～15 min，给各组动物腹腔注射戊巴比妥钠，以翻正反射消失为指标，观察受试样品能否延长戊巴比妥钠睡眠时间。

1.3.2.3 戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验

做正式实验前先进行预实验，确定戊巴比妥钠阈下催眠剂量，即80%～90%小鼠翻正反射不消失的戊巴比妥钠最大阈下剂量。动物末次给予溶剂及不同浓度受试样品后，出现峰作用前10 min～15 min，给各组动物腹腔注射戊巴比妥钠最大阈下催眠剂量（本实验剂量为：20 mg/kg·BW），记录30 min内入睡动物数（翻正反射消失达1 min以上者）。

1.3.2.4 巴比妥钠睡眠潜伏期实验

做正式实验前先进行预实验，确定使动物100%入睡，但又不使睡眠时间过长的巴比妥钠的剂量，用此剂量正式实验。动物末次给予溶剂及不同浓度受试样品10 min～20 min后，给各组动物腹腔注射巴比妥钠（本实验剂量为：295 mg/kg·BW），以翻正反射消失为指标，观察受试样品对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响。

1.4 统计学方法

数据采用SPSS 17.0进行统计分析。睡眠时间为计量资料，数据采用方差分析进行统计，对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。入睡动物数为计数资料，采用χ2检验。

2 结果与分析

2.1 天麻超微粉在大鼠体内吸收情况

2.1.1 天麻素的色谱图及标准曲线

天麻素在220 nm处有最大吸收峰，其保留时间为5.91 min，在血浆样品中，目标峰也与其他杂峰分离良好。在规定的色谱条件下，作天麻素浓度X-相应峰面积Y的线性回归方程，其回归方程为Y= 18781X+ 2435.7，R2= 9999（图 2）。

图2 天麻素标准品液相色谱图（A）及标准曲线（B）Fig.2 HPLC chromatogram of gastrodin standards（A）and standard curve of gastrodin（B）

2.1.2 天麻超微粉中天麻素的含量

在给定的色谱条件下测定天麻超微粉样品，测定出的天麻素峰面积积分值后，按对应的线性方程计算其含量，分别测定3次，结果见表1，本实验所用受试物天麻超微粉中天麻素的含量0.24%。

表1 天麻超微粉中天麻素含量测定结果Table 1 The content of gastrodin in the Gastrodia elata Bl.ultrafine powder %

2.1.3 天麻超微粉中天麻素的生物利用度

天麻素在220 nm处有最大吸收峰，其保留时间为5.91 min，在血浆样品中，目标峰也与其他杂峰分离良好。高效液相色谱仪中测得的各时间点峰面积比值代入到的标准曲线方程中，计算大鼠血浆中天麻素浓度。大鼠血浆中天麻素浓度－时间曲线见图3，天麻超微粉的绝对生物利用度达60.77%。

图3 大鼠静脉注射天麻素、灌胃天麻超微粉后血浆中平均天麻素浓度－时间曲线Fig.3 Mean plasma concentration-time curve of gastrodin i.v.treated group and the Gastrodia elata Bl.ultrafine powder i.g.treated group in rats

2.2 天麻超微粉改善睡眠功能

2.2.1 天麻超微粉对小鼠体重的影响

实验开始前，称量实验小鼠初始体重，并根据小鼠体重随机分组。灌胃结束时，称量实验小鼠终体重，并对实验数据进行统计分析，见表2。

表2 天麻超微粉对小鼠体重的影响Table 2 The effect data of Gastrodia elata Bl.ultrafine powder on body weight of mice

从表2可以看出，天麻超微粉低、中、高剂量组的实验小鼠初始体重和终体重与空白对照组比较差异均不显著（P＞0.05），表明天麻超微粉对小鼠的体重增长无影响。

2.2.2 天麻超微粉直接睡眠实验

各试验组给予受试样品，阴性对照组给予同体积溶剂后，经观察30 min，翻正反射存在，未出现睡眠现象。

2.2.3 天麻超微粉对小鼠戊巴比妥钠睡眠时间的影响

各组动物睡眠时间经方差齐性检验，sig=0.175＞0.05，所以，接受原假设，认为因素是方差相等的，经方差分析，其组间差异没有达到显著性水平（P＞0.05，表3）。说明该受试样品没有显著延长戊巴比妥钠睡眠时间的作用。

表3 天麻超微粉对小鼠戊巴比妥钠睡眠时间的影响Table 3 Effects of tested drug on sleep time induced by pentobarbital sodium in mice

2.2.4 戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验

低、中、高剂量组动物入睡率与阴性对照组相比较，差异均有统计学意义（P＜0.05，表4）。说明该受试样品可以增加戊巴比妥钠阈下剂量动物入睡率。

表4 天麻超微粉对小鼠戊巴比妥钠阈下剂量催眠作用的影响Table 4 Effects of test drug with sub-threshold dose of sodium pentobarbital on sleeping rate of mice

2.2.5 巴比妥钠睡眠潜伏期实验

低、中、高剂量组动物巴比妥钠睡眠潜伏期与阴性对照组相比，差异具有显著性（P＜0.05，表5）。说明该受试样品可使睡眠潜伏期缩短，受试样品与巴比妥钠有协同作用。

表5 天麻超微粉对小鼠巴比妥钠睡眠潜伏期的影响Table 5 Effect of tested drug with sodium barbital on the sleep incubation period of mice

3 讨论与结论

天麻中主要活性成分为天麻素，本实验所用受试物天麻超微粉中含有天麻素含量0.24%，天麻素的绝对生物利用度达60.77%，较接近直接灌胃天麻素的生物利用度[12]，说明微粉化处理有利于天麻有效成分的消化吸收。本研究结果表明，经口灌胃给予小鼠不同的受试物30 d，空白对照组、天麻超微粉三个剂量组小鼠在60 min内，均未发现有直接睡眠现象，并且该天麻超微粉对小鼠的体重增加无明显影响。40、400和 1200 mg/kg·BW天麻均具有协同戊巴比妥钠阈下剂量催眠作用，能缩短巴比妥钠睡眠潜伏期，提示该天麻与戊巴比妥钠和巴比妥钠有明显的协同作用，根据卫生部《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）中的判定标准，该天麻超微粉具有改善睡眠功能作用。此结果与齐丽娟等[13]的研究结果相似，但本实验中天麻粉的灌胃剂量显著低于上述报道中普通粉的灌胃剂量（约为1/2剂量），原因可能是超微粉化能增加比表面积和孔隙率，进而提高有效成分在体内的吸收率。胥佳等发现超微粉碎处理有利于葡萄籽中原花青素的释放[14]，刘素稳等研究发现超微粉碎能显著提高鲍菇粉的比表面积和多糖溶出率[15]，这些体外实验也证明超微粉化能提高有效成分的溶出和释放。本实验结果表明微粉化能够提高天麻粉中天麻素的生物利用度，进而提高其改善睡眠功能的效果。本研究为天麻超微粉功能食品的制剂开发与应用提供科学依据。

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