纤维素降解固氮芽孢杆菌的筛选和鉴定

陶树兴，郭 贤，梁 健，柴 霞，张娟妮，魏园媛，冯晓磊

（陕西师范大学 生命科学学院，陕西 西安 710062）

化肥是农业生产中最基础而且是最重要的物质投入，是提高土壤肥力和作物单位面积产量的重要措施.据联合国粮农组织（UAO）统计，化肥在对农作物增产的总份额中约占40%～60%［1］.近年来随着化肥的长期使用和使用量的增加，其增产效应并未相应增加，且大量使用化肥所带来的土壤板结、肥力退化、污染环境等负效应也日益明显［2］.农业的可持续发展，需要提倡使用有机肥和其他新型肥料［3－4］.生物固氮是固氮微生物将大气中的氮还原成氨的过程，将固氮微生物菌剂施入土壤，可提高土壤氮素含量，促进作物生长.微生物肥料起作用的是活的微生物，其效率取决于菌种的特性和产品中活菌的数量.我国微生物菌剂国家标准对活菌数和保质期有明确规定.国内现已进行产品登记的自生固氮菌肥料，生产菌种一般都使用圆褐固氮菌（Azotobacterchrooccum），该菌株不产生芽孢，易失活，产品保存期短.芽孢杆菌具有容易培养、抗逆性强、存活期长等优点，筛选能固氮的芽孢杆菌作为生物固氮菌剂的菌种已受到重视［5－6］.固氮微生物将氮气还原成氨要消耗大量的三磷酸腺苷（ATP），对自生固氮菌来说，ATP主要来源于糖类物质的生物氧化［7］.由于圆褐固氮菌等自生固氮微生物不能降解纤维素，土壤中单糖、淀粉等糖类的含量有限，使固氮微生物的生长和固氮效率受到限制，直接影响固氮菌剂作用的发挥.作物的残留物和施入土壤的有机肥含有大量的纤维素，能为利用纤维素的固氮微生物提供所需的碳源和能源，筛选兼具固氮能力与纤维素降解能力的芽孢杆菌，作为生产固氮菌肥料的菌种和进一步研究的实验菌株，为固氮微生物的研究和应用提供了另一种思路.

1 材料和方法

1.1 对照菌株

圆褐固氮菌（Azotobacterchrooccum）10098，由中国农业微生物菌种保藏中心提供.

1.2 培养基

纤维素无氮培养基（g/L）:微晶纤维素20，磷酸氢二钾0.4，硫酸镁0.4，氯化钠0.4，硫酸钙0.4，碳酸钙10，硫酸锰0.02，硫酸亚铁0.02，1%钼酸钠溶液1mL/L，1%硼酸溶液1mL/L，固体培养基加琼脂20g，pH 值为7.2～7.4，121℃高压蒸汽灭菌30min.测定固氮效率时用葡萄糖代替微晶纤维素，113℃高压蒸汽灭菌30min.

1.3 固氮芽孢杆菌的分离与纯化

1.3.1 土壤样品的采集 从陕西省长安、三原、户县、铜川、勉县、南郑、洛川、延安，山西省晋城、大同、交城，山东省烟台，湖北省武汉等地的小麦、玉米、果树、蔬菜等根际，共采集土壤样品24份，样品用灭菌牛皮纸袋包装.

1.3.2 富集培养 称5g土样放入灭菌过的装有玻璃珠和45mL无菌水的三角瓶中，然后在160 r/min、28℃振荡30min.取上述土壤悬液各5mL分别转入微晶纤维素无氮液体培养基中，在160 r/min、28℃振荡培养4d.重复上述操作一次，完成第二次富集培养.

1.3.3 固氮芽孢杆菌的分离纯化 吸取5mL增殖培养后的菌液接入45mL含玻璃珠的无菌水中，160r/min振荡30min得10－1菌悬液，置80℃水浴10min，依次做10倍系列稀释至10－6.每个稀释度取0.1mL菌悬液涂布在微晶纤维素无氮固体培养基分离平板上，28℃培养4d，选取不同特征且直径较大的菌落再用平板划线法进行分离纯化.

1.4 菌株生长量的测定

将2mL菌液接入48mL液体培养基，28℃培养3d，用显微镜直接计数选出生长速度快的菌株，再用平板菌落计数测定液体培养物的生长量［8］.

1.5 纤维素酶活性测定

将培养3d的发酵液于4 500r/min离心15 min，上清液即为粗酶液，以pH值为7.2的磷酸缓冲液配制微晶纤维素，经160r/min振荡24h湿磨，将湿磨过的底物与粗酶液混合，在32℃保温30 min（依据反应初速度确定），用DNS法测定还原糖的生成量［9］，纤维素酶活力单位（U）定义为32℃，pH值为7.2条件下反应30min，每毫升酶液每秒钟产生的葡萄糖的mol数表示.

1.6 固氮效率的测定

将2mL菌液接入48mL葡萄糖无氮液体培养基中，28℃、160r/min振荡培养3d.用DNS法测定剩余葡萄糖的含量［9］，微量凯氏定氮法测定含氮量［10］.固氮效率以每消耗1g葡萄糖所固定的氮量（mg）表示.

1.7 黄瓜盆栽试验

选取大小一致的津优40号黄瓜种子用无菌水浸泡18h后播种于育苗杯中，每杯播1粒种子，待真叶长到两叶一心时进行移栽.移栽塑料花盆直径25cm，高17cm，每盆装耕作土壤1 500g，每盆移栽1株，每个处理重复3盆，置温室内培养.黄瓜幼苗移栽1d后进行处理，每盆浇50mL不同液体，生长期间每隔10d按同法浇施一次，20d和30d后分别拍照，收获植株，测定植株高度、生物量、含氮量等.

盆栽试验共设8个处理:（1）无菌水对照（CK1）；（2）纤维素无氮液体培养基对照（CK2）；（3）化学氮肥对照（CK3），成分为（g/L）:尿素 0.12g，Na2HPO4·12H2O 0.15g，MgSO4·7H2O 0.12 g，柠檬酸铁0.005g，CaCl2·2H2O 0.1g，KH2PO40.1g，Gibson微量元素液1mL，H2O 1000mL，pH6.5～7.0.Gibson微量元素液成分:H3BO32.86 g，ZnSO4·7H2O 0.22g，GuSO4·5H2O 0.08g，MnSO4·4H2O 2.03g，Na2Mo4·2H2O 1.26g，H2O 1000mL；（4）阳性对照菌株圆褐固氮菌10098菌液（CK4）；（5）固氮芽孢杆菌 AX31菌液；（6）固氮芽孢杆菌BX31菌液；（7）固氮芽孢杆菌CX21菌液；（8）固氮芽孢杆菌DX23菌液.

1.8 数据分析

采用SPSS16.0统计分析软件完成.

1.9 菌种鉴定

1.9.1 形态学观察 将固氮芽孢杆菌涂布于以微晶纤维素为碳源的无氮培养基上，28℃培养48～72 h，观察记录菌落形状、大小、颜色、边缘、表面光滑度等.用常规制片法和染色法观察细胞的形状、大小、两端形状、细胞排列方式、荚膜、芽孢及位置等.

1.9.2 生理生化测定 参考《常见细菌系统鉴定手册》［11］和《伯杰细菌鉴定手册》［12］.

1.9.3 16SrDNA序列分析与系统学分析 16S rDNA基因序列分析由上海生工生物工程有限公司完成；基因比对采用美国国家生物技术信息中心NCBI数据库BLAST在线完成，系统学分析建树采用软件MEGA 4完成.

2 结果分析

2.1 利用纤维素的固氮芽孢杆菌的筛选

2.1.1 利用纤维素的固氮芽孢杆菌的分离 从24个土壤样品中共分离到42株利用微晶纤维素的固氮芽孢杆菌菌株，其中编号为AX31、BX31、CX21和DX23的4株生长较快，在微晶纤维素无氮液体培养基中，28℃160r/min振荡培养72h菌数可达到1×109个/mL（cfu）以上.

2.1.2 4株固氮芽孢杆菌的纤维素酶活性和固氮效率 4株利用纤维素的固氮芽孢杆菌的纤维素酶活性和固氮效率见表1，以圆褐固氮菌10098作为对照菌株，表中数据为3个重复的平均值和标准差.

表1 4株固氮芽孢杆菌的纤维素酶活性和固氮效率＊Tab.1 Cellulase activity and N fixation efficiency of 4nitrogen-fixing bacilli

通过方差分析及LSD法多重比较显示，4株固氮芽孢杆菌中，菌株CX21的纤维素酶活性显著高于AX31、BX31和DX23（P＜0.01）.菌株 DX23纤维素酶活性较低，菌株AX31和BX31纤维素酶活性差异不显著（P＞0.05）.菌株CX21的固氮效率最高，与其他3个菌株之间差异极显著（P＜0.01），其固氮效率与对照菌株10098相当.

2.1.3 4株固氮芽孢杆菌对黄瓜生长的影响 浇施利用纤维素的固氮芽孢杆菌CX21的菌液后，黄瓜植株长势明显比对照CK1、CK2和AX31、BX31、DX23好，植株高，叶片大.植物生物产量和全氮含量与化学氮肥处理CK3和对照菌株10098相当，差异不显著（P＞0.05）（表2）.

2.2 固氮芽孢杆菌CX21的鉴定

从菌体生长、纤维素酶活性、固氮效率和黄瓜盆栽试验结果可以确定，固氮芽孢杆菌CX21是一株有潜在应用价值的固氮芽孢杆菌菌株.

表2 固氮芽孢杆菌对黄瓜生长和植株总含氮量的影响Tab.2 The effect of nitrogen-fixing bacilli on cucumber plant′s growth and total nitrogen content

2.2.1 固氮芽孢杆菌CX21的形态学观察 固氮芽孢杆菌菌株CX21在无氮培养基平板上菌落圆形，边缘整齐，无色透明，光滑有光泽，呈半粒水珠状，粘稠有弹性，挑起时可拉成丝（图1a）.菌体杆状，大小为0.79～1.3μm×2.5～5.2μm，革兰氏染色为阳性（图1b）；菌体外有很肥厚的荚膜（图1c）；培养3d后菌体内形成芽孢，芽孢位于菌体中央，椭圆形，直径不大于菌体宽度（图1d）.

2.2.2 固氮芽孢杆菌CX21的生理生化特征 固氮芽孢杆菌CX21能利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇等为碳源，不能利用木糖、核糖；最适培养温度为28～30℃，NaCl浓度高于1.0%时生长受抑制；接触酶反应为阳性，液化明胶，水解淀粉，使石蕊褪色，牛奶胨化；氧化酶试验、V-P反应、卵磷脂酶、硝酸盐还原、甲基红、柠檬酸盐利用均为阴性.

图1 菌株CX21形态学特征Fig.1 Morphological characteristics of strain CX21

2.2.3 固氮芽孢杆菌CX21的16SrDNA序列分析 测序得到的固氮芽孢杆菌CX21的16SrDNA序列的长度为1 460bp，将序列经NCBI数据库BLAST在线比对，结果显示固氮芽孢杆菌CX21与Paenibacillusmucilaginosu（登陆号JF810844.1）的同源性达到99%以上.从GenBank中调取与CX21同源性较高的10株菌株的16SrDNA序列构建系统发育进化树（图2），结果显示CX21在进化树中与Paenibacillusmucilaginosu的同源关系最近.根据固氮芽孢杆菌CX21的形态特征、生理生化特性和16SrDNA序列分析，参考《常见细菌系统鉴定手册》和相关胶质类芽孢杆菌的研究［13－15］，将筛选到的利用纤维素的固氮芽孢杆菌菌株CX21鉴定为胶质类芽孢杆菌Paenibacillusmucilaginosus.

图2 固氮芽孢杆菌CX21系统学分析Fig.2 Phylogenetic tree of nitrogen-fixing bacillus CX21

3 讨论

微生物肥料起作用的是活的微生物，其效率取决于菌种的特性和产品中活菌的数量.圆褐固氮菌是国内外生产生物固氮菌剂常用的菌种，由于该菌株不产生芽孢，易失活，产品保存期短，筛选具有固氮能力的芽孢杆菌因而受到重视.早年发现的固氮芽孢杆菌菌株主要是类芽孢杆菌属的Paenibacilluspolymyxa、P.macerans和P.azotofixans［16－18］；之后又陆续发现了P.peoriae、P.graminis、P.odorifer、P.brasilensis、P.zanthoxyli和P.forsythiae［19－23］.近年来我国学者也相继发现芽孢杆菌属（Bacillus）中具有固氮能力的新菌种［5－6］，这些菌株一般都是以蔗糖、葡萄糖、甘露醇或淀粉作为碳源分离获得［6］，仅少数菌株在菌种鉴定时表明可分解纤维素.我们在菌种分离筛选时以微晶纤维素为碳源，分离到多株能固氮的芽孢杆菌，丰富了固氮菌资源及其筛选策略.我们获得的固氮芽孢杆菌菌株CX21，生长较快，固氮能力较强，黄瓜盆栽试验结果与对照菌株圆褐固氮菌10098和施用无机氮肥的结果相当.在大田环境中，单糖和淀粉含量比较低，而作物的残留物和施入的有机肥含有大量纤维素，利用纤维素的固氮芽孢杆菌具有更强的竞争适应优势.

对固氮微生物固氮能力的研究有微量凯氏定氮法、乙炔还原法测定固氮酶活性、15N示踪法和盆栽试验等.目前的研究中，乙炔还原法和15N示踪法在同一研究中还存在结果不对应等问题，与盆栽试验结果并不总是正相关［6］.我们以菌株生长速率、固氮效率和盆栽试验结果进行评定，微量凯氏定氮法虽较麻烦，但结果与盆栽试验结果较吻合.

氨的分泌和氨对固氮酶的阻遏效应是影响自生固氮微生物增加土壤肥力的限制因素［7］，获得能将固氮产生的氨分泌到细胞外的菌株及抗氨效应的菌株是利用自生固氮微生物提高土壤肥力需要攻克的难题.就利用纤维素的固氮芽孢杆菌而言，纤维素酶的合成与调节、生物固氮的调节以及氨的分泌等，也是需要研究的重要课题.

4 结论

用微晶纤维素无氮培养基从不同地区不同植物根际的24个土壤样品中分离到42株固氮芽孢杆菌，其中固氮芽孢杆菌CX21纤维素酶活性和固氮效率较高.黄瓜盆栽试验结果表明，浇施固氮芽孢杆菌CX21菌液，植株高度、植物生物产量和全氮含量同化学氮肥对照和对照菌株圆褐固氮菌10098的效果相当，无显著差异（P＞0.05）.根据固氮芽孢杆菌CX21的形态特征、生理生化特性和16SrDNA序列分析，将筛选到的利用纤维素的固氮芽孢杆菌菌株CX21鉴定为胶质类芽孢杆菌Paenibacillus mucilaginosus.

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