利用肽配体库分析蛋清中低丰度蛋白质组

刘怡君，邱 宁，马美湖*

(1．国家蛋品加工技术研发分中心，华中农业大学 食品科技学院，湖北 武汉 430070;2．大连市食品检验所，大连市食品药品监督管理局，辽宁 大连 116630)

蛋清中蛋白质含量是蛋品品质评价的重要指标之一［1－3］。蛋以及蛋制品中的蛋白质研究是提升其价值的重要研究方向，一方面，蛋白质的功效性研究有利于控制蛋品品质;另一方面，具有生物学特性的蛋白质提取与纯化有利于增加蛋品的附加值［4］。获取蛋清中低丰度蛋白质的信息不仅能够为蛋品品质分级提供参考依据，更可为蛋及蛋制品品质评价提供检测的分析基础和信息平台［5］。蛋清低丰度蛋白质的发现和发展得益于蛋白质组学研究的深入［6－8］，低丰度蛋白质组学是研究蛋白质功能的必然方向，蛋清中低丰度蛋白质的检测对蛋及蛋制品的品质评价具有重要意义。

蛋清中低丰度蛋白质的研究思路大多与蛋白质组学的研究思路相吻合［9－11］，需要先去除高丰度蛋白质，使蛋清中低丰度蛋白质得到更高效的分离［12－14］。但去除高丰度蛋白质的同时，很多低丰度蛋白质亦被去除。

肽配体库技术(CPLL)能够满足低丰度蛋白质组学研究更高效和更便捷的检测需求［15－17］。其原理不同于其他低丰度蛋白质研究方法［18－20］，CPLL能够在不去除高丰度蛋白质的同时将低丰度蛋白质富集，使蛋清蛋白质丰度均衡化［21－24］。这避免了去除高丰度蛋白质同时去除低丰度蛋白质的风险，也使分析过程中容易受高丰度蛋白质影响的低丰度蛋白质得以检测。

CPLL利用特有的六肽配基，与蛋白质发生特异性吸附，能够获得丰度均衡化的蛋白质溶液［17］。这种特异性吸附受益于六肽配体的特殊性质，六肽配体由20种氨基酸键连接6个肽配体，大量种类不同的六肽意味着，在理论上，任何蛋白质均能够得到吸附。实际样品中，蛋白质与肽配体的相互作用很可能受到静电作用、离子相互作用、亲和相互作用、疏水相互作用等的影响［25］。不同结合方式的蛋白质，解离强度的差异会影响蛋白质的均衡化程度。因此，本文研究了盐浓度、pH值、洗脱液顺序对CPLL丰度均衡化效率的影响。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

FE20型pH计、FE30电导率仪(Mettler Toledo，美国);HERAcell 150I恒温培养箱(Thermo，美国);真空冷冻干燥箱(Hidolph，德国);LTQ－Orbitrap质谱仪(Thermo Electron，德国);Gel－Pro analyzer(Media Cybernetics，美国);PDQuestc_v8.0.1、iMark酶标仪、分光光度计(Bio－Rad，美国)。

ProteoMinerTMCPLL(Bio－Rad，美国);预染色蛋白质(Marker BR Fermentas，美国);胰酶(Promega);丙酮(99%，Promega，美国);裂解液(LB，Bio－Rad，美国);再水化液(99%，Bio－Rad，美国);碘乙酰胺、乙腈(99.9%)、硫代硫酸钠(99%)、胎牛血清标准品(BSA)、胰酶溶液、铁氰化钾(99%)、甲酸(99.9%)、三氟乙酸(TFA，99%)和二硫苏糖醇(99%)均购自Sigma公司;甲醇(99.9%，Fisher);实验用水均由Milli-Q纯水系统制备。PBS缓冲液:150 mmol/L NaCl，10 mmol/L NaH2PO4(pH 7.4)，尿素CHAPS(3-［3-(胆酰胺丙基)二甲氨基］-1-丙磺酸内盐):8 mol/L尿素，2%CHAPS，5%乙酸，HOS(有机水溶液):6%乙腈，12%异丙醇，2%氨，80%水。

1.2 样品前处理

1.2.1 样品采集 样品均来自华中农业大学动物饲养中心。鸡蛋品种均为白兰航，随机采样24 h内非受精新鲜鸡蛋。随机取15个新鲜鸡蛋，将蛋清与蛋黄分离，收集蛋清于烧杯中，利用磁力搅拌器搅拌直至烧杯中的蛋清完全均匀。为抑制蛋清中的蛋白酶活性，全程操作温度≤4℃。蛋清均分成3等份，每份100 mL，分别记为A，B，C。A加入PBS固体使蛋清pH值为7.4，含150 mmol/L NaCl;B加入固体盐粉，使蛋清溶液含有缓冲盐25 mmol/L KH2PO4，150 mmol/L NaCl，pH 8.8;C为蛋清原液，实测pH 8.8。

1.2.2 CPLL富集 ProteoMinerTM试剂盒(Bio－Rad，美国)。离心柱装有500 μL珠浆(20%珠粒，20%含水乙醇)。使用PBS缓冲溶液将柱体活化后，分别将蛋清溶液A，B，C与ProteoMinerTM肽配体于20℃室温振摇2 h，充分富集。富集过程中，蛋清粘蛋白的聚集体在珠球周围形成白色沉淀，并消除。使用大量的缓冲液以除去过量的可溶性蛋白，使用不同序列的两个连续的洗脱液:先HOS(C1)，后尿素CHAPS(C2);另一组蛋清溶液先C2后C1洗脱。每个过程重复3次。

1.3 蛋白质组分析

1.3.1 十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE) 凝胶样品通过12.5%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。12.5%分离胶，4%浓缩胶。样品加热5 min，180 V恒定电位。凝胶染色，考马斯蓝(Bio－Rad，CA)。对5个差异条带进行切带，脱色(脱色液配制:30 mmol/L K3Fe(CN)6－100 mmol/L NaS2O3=1∶1)，脱水，酶切(1.25 mmol/L NH4HCO3稀释胰酶至12.5 ng/μL)。每管胶粒加入胰酶3 μL，冰浴15 min，加入3 μL 25 mmol/L NH4HCO3，收集液真空浓缩后进行肽段浓缩除盐，得待测蛋白质溶液。

1.3.2 线性离子阱回旋共振质谱(LTQ)条件 多肽首先经C18反相柱(100 μm i.d．，长10 cm，5 μm)，肽段在反向柱上的洗脱梯度为5%～40%乙腈流动相(A为0.1%甲酸，B为含0.1%甲酸乙腈)洗脱90 min，流速300 nL/min。从反相柱上洗脱的肽段直接用质谱LTQ－Orbitrap检测:离子传输管温度为200℃;电压1.9 kV，一级质谱在Orbitrap扫描，扫描范围350～1 800 Da，分辨率为6 000(m/z 400处)，二级质谱分析在LTQ用CID碰撞模式完成。1个全扫描后选取最强的6个母离子做二级质谱;动态排除如下设置:在30 s内串联质谱扫描重复2次的母离子，在60 s内不再进行串联质谱扫描。

数据使用BIWORKS软件处理转换为MGF格式文件，通过搜索MASCOAT数据库鉴定蛋白质。原始文件识别肽段数4 170和P＜0.01肽后验误差概率(PEP)和预设的错误发现率(FDR)为0.01，实验重复3次。

2 结果与讨论

2.1 盐浓度对蛋清pH值与电导率的影响

图1为新鲜蛋清加入PBS缓冲盐后其pH值与电导率的变化情况，新鲜蛋清蛋白质溶液呈弱碱性环境;随缓冲盐含量的升高，蛋清溶液的pH值下降、电导率增加，蛋白质溶液离子间的相互作用增强。

2.2 C1－C2洗脱结果

图1 缓冲盐对蛋清pH值和电导率的影响Fig.1 pH values and conductivities corresponding to different salt protein chicken egg white solution buffer:150 mmol/L NaCl with different concentration of NaH2PO4

经过活化的CPLL对A，B，C吸附程度不同(见图2)。图2非方框区域，左为标尺(MW)和未经CPLL处理过的蛋清原液(Native);方框区域A为样品 A经过 CPLL富集，C1连续洗脱两次(C1E1，C1E2)和C2连续洗脱两次(C2E1，C2E2)的SDS－PAGE分析结果。方框区域B和C分别为样品B和样品C经过CPLL富集后，C1－C2连续洗脱两次的结果比较。

图2 C1－C2洗脱顺序对A，B，C蛋白溶液丰度均衡化的影响Fig.2 Effect of C1－C2 elution sequence on the A，B and C protein solution abundance equilibrium

从图2可见，与未经处理的蛋清原液相比，CPLL能够使蛋清中蛋白质达到丰度均衡化的效果。蛋清蛋白质原液的蛋白质分子量集中在72 kDa(卵转铁蛋白)、43 kDa(卵清白蛋白)、15 kDa(卵转铁蛋白)。经过CPLL丰度均衡化处理后，A，B，C 3个样品中其他分子量蛋白质得到了有效富集(见图2虚线部分)。

通过对比A，B，C 3个样品发现，盐浓度不同，其CPLL的富集效率不同。样品B的富集效率最高。在样品B盐浓度的调节下，C1连续两次洗脱能够使富集后蛋清蛋白质洗脱相对彻底。

样品B在C1洗脱完成后，C2洗脱1次可使溶菌酶得到高效分离。这说明，先C1后C2洗脱强度差与溶菌酶在CPLL基质吸附强度差相当。

2.3 C2－C1洗脱结果

在相同活化条件、不同洗脱顺序下，样品A，B，C的CPLL富集效率不同(图3)。图3非方框区域，左为标尺(MW)和未经CPLL处理过的蛋清原液(Native);方框区域A为样品A经过CPLL富集，C2连续洗脱两次(C2E1，C2E2)和C1连续洗脱两次(C1E1，C1E2)的SDS－PAGE分析结果。方框区域B和C分别为样品B和样品C经过CPLL富集后，C2－C1连续两次洗脱的结果比较。由图3可知，C2洗脱液能够对富集CPLL蛋白质实现高效洗脱。样品B盐溶液条件下的洗脱效率比样品A，C的洗脱效率高。

图3 C2－C1洗脱顺序对A，B，C蛋白溶液丰度均衡化的影响Fig.3 Effect of C2－C1 elution sequence on the A，B and C protein solution abundance equilibrium

2.4 质谱

图4为蛋清溶液B(pH 8.8的25 mmol/L磷酸盐缓冲液+150 mmol/L NaCl)，经C2洗脱后的蛋白质分布。由图4可知，SDSPAGE凝胶电泳条带的清晰度随上样蛋白质净含量的增大而更显著。增加蛋清蛋白质的净含量可提高LTQ质谱检出率。本研究中取60 μg对应条带上5个区域的胰蛋白酶经酶切后进行LTQ质谱检测。根据质谱检测结果，通过比对鸡蛋白质序列数据库(NCBInr)和接受唯一的亲蛋白的鉴定，检出45个蛋白，结果见表1。

图4 蛋白质含量对SDS－PAGE灰度的影响Fig.4 Effect of protein content on SDS－PAGE gray scale

根据已有文献报道，D’Ambrosio等［23］利用CPLL结合表面增强激光解吸电离质谱(SELDI－MS)确定了148个独特的蛋清中蛋白质种类;Mann等［7］利用数字化线性离子阱质谱(LTQ Orbitrap Velos)先进的计算方法获得了158个蛋白质的检测结果。本研究优化了CPLL前处理方法，选取差异条带进行LTQ质谱检测，获得了2种尚未见报道的蛋清蛋白质，分别为229 kDa的蛋白和CCDC42假想蛋白。45种蛋白质的亚细胞位置分析见图4，其中分泌蛋白和未知蛋白所占比例最大，分别为13个和12个，质膜蛋白7个，其他细胞间蛋白8个，胞外蛋白5个。

表1 45个蛋清蛋白质的质谱鉴定结果Table 1 45 Unique gene products found in egg white by LTQ

(续表1)

由表1可知，卵清蛋白、卵转铁蛋白与溶菌酶是蛋清中的高丰度蛋白质。在所选取的差异条带中，检测到高丰度蛋白质的可能原因分析如下:①高丰度蛋白质可能与低丰度蛋白质发生相互作用，使高丰度蛋白质与低丰度蛋白质同时被检测;②降解情况的发生使高丰度蛋白质形成多肽，进行SDSPAGE分析时高丰度蛋白质等电点发生变化，导致其与低丰度蛋白质的条带重合而被检测。这种以差异蛋白质条带为目标的检测，在某种程度上增大了低丰度蛋白鉴定的可靠性，避免了质谱鉴定过程中因高丰度蛋白质干扰而造成的质谱鉴定灵敏度降低。

2.5 蛋清蛋白质亚细胞定位分析

根据表1中列出的45种蛋白质的质谱信息，通过UniProtKB/Swiss－Prot数据库检索，获得这些蛋白质的亚细胞定位结果(图5)。45种蛋白质中有19种蛋白质与鸡胚发育关系密切，可能参与某些生物活动并发挥功能。此外，其中一些蛋白质的亚细胞定位不是蛋清，差异条带中检测到的蛋白质，分泌型蛋白质相对较多。据推测，这些蛋白质在蛋清中出现很可能是源于鸡胚形成过程输卵管壁等遗留蛋白。同时有部分是细胞器中的蛋白质，未知亚细胞位置的蛋白质占较大比重。

图5 蛋清蛋白亚细胞定位(描述来源UniProtKB/Swiss－Prot数据库)Fig.5 Subcellular location of proteins identified in egg white corresponding to Table 1 by description and origin of the protein in UniProtKB/Swiss－Prot

3 结论

蛋清中低丰度蛋白质丰富，利用肽配体库技术可高效、快速地分析蛋清中的低丰度蛋白质组。先HOS后尿素CHAPS连续洗脱能够获得高纯度溶菌酶，该洗脱方式扩大了肽配体库的使用范围。提高CPLL对低丰度蛋白质的吸附和洗脱效率的最优条件为:pH 8.8，25 mmol/L磷酸盐缓冲液，150 mmol/L NaCl。实验结果表明:通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，线性离子阱质谱检测的分析方法，能够使蛋清中低丰度蛋白质的检测达到亚细胞水平。

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