IL-12B基因多态性及血清表达水平与食管癌的关系

彭丽娟 杜经纬 徐 俊 常晋霞 胡为民 潘万龙.川北医学院微生物学与免疫学教研室，四川南充67000；.四川省南充市中心医院耳鼻咽喉科，四川南充67000；.四川省南充市中心医院心胸外科，四川南充67000

IL-12B基因多态性及血清表达水平与食管癌的关系

彭丽娟1杜经纬2徐 俊3常晋霞1胡为民1潘万龙1
1.川北医学院微生物学与免疫学教研室，四川南充637000；2.四川省南充市中心医院耳鼻咽喉科，四川南充637000；3.四川省南充市中心医院心胸外科，四川南充637000

目的探讨白细胞介素（IL）-12B 3′UTR+16974（A/C）位点单核苷酸多态性（SNP）及其血清表达水平与食管癌的关系。方法随机选取2013年6月～2014年6月在四川省南充市中心医院就诊的食管癌患者52例为试验组，术后收取患者肿瘤组织和癌旁组织，提取其基因组DNA，针对IL-12B基因3′UTR+16974（A/C）SNP位点进行PCR，扩增产物测序，其中患者肿瘤组织DNA作为癌组织，癌旁3～5 cm组织DNA作为癌旁组织，分析IL-12B基因多态性与肿瘤发生的关系。选取同期健康体检者40例为对照组，同时收集患者和健康体检者血清，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测IL-12 p40和IL-12血清表达水平。结果癌组织AA、AC、CC基因型频率分别是23.08%、15.38%、61.54%，癌旁组织AA、AC、CC基因型频率分别是15.38%、38.46%、46.15%，差异有统计学意义（P＜0.05）。癌组织A、C等位基因频率分别为30.77%（32/104）、69.23%（72/104），癌旁组织A、C等位基因频率分别为34.62%（36/104）、65.38%（68/104），差异无统计学意义（P＞0.05）。试验组IL-12 p40和IL-12血清表达水平均明显高于对照组（P＜0.01）。结论IL-12B 3′UTR+16974（A/C）位点CC基因型可能是食管癌的易感基因型，IL-12 p40和IL-12血清表达水平升高与食管癌发生有关。

食管癌曰白细胞介素-12曰白细胞介素-12B曰多态性曰单核苷酸

白细胞介素（interleukin，IL）-12B是一种70 kD的糖蛋白，由相对分子质量为35（p35）和40（p40）（分别由IL-12A基因和IL-12B基因编码）的两条多肽链组成的异二聚体。IL-12B基因16974 A/C在羧基端非翻译区具有多态现象，影响IL-12的产生与表达，并与Th1介导的疾病有关，如硅沉着病［1］、Graves眼病［2］、宫颈癌［3］等。研究发现，胃癌患者IL-12血清表达水平与疾病的严重程度有关［4］。本研究拟探讨IL-12B基因多态性及血清表达水平与食管癌的关系，为寻找食管癌新的遗传标记、食管癌诊断提供新依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2013年6月～2014年6月在四川省南充市中心医院（以下简称“我院”）就诊的食管癌患者52例为试验组，其中男36例，女16例，平均年龄（63.81± 9.07）岁，均适宜做手术，术前均未接受放、化疗，术后均经病理组织学确诊为鳞状细胞癌，无其他肿瘤病史。根据美国癌症联合委员会（AJCC）第七版公布的食管癌分期为标准对患者进行分期。同时选取我院同期健康体检者40例为对照组，其中男25例，女15例，平均年龄（45.35±8.72）岁，血常规、肝肾功、甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、糖类抗原（CA）242、CA125指标显示无明显异常。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取及引物合成肿瘤组织DNA作为癌组织，癌旁组织DNA作为癌旁组织。分别收集患者术后新鲜肿瘤组织和癌旁3～5 cm组织10～20 mg，采用组织基因组DNA提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）快速提取DNA，-20℃保存。根据文献设计包含IL-12B 3′UTR+16974 A/C位点SNP上游引物5′-GATATCTTTGCTGTATTTGTATAGTT-3′，下游引物5′-AATATTTAAATAGCATGAAGGC-3′，由武汉华大基因科技有限公司合成。

1.2.2 PCR反应及测序PCR扩增体系为25 μL，DNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，dNTP 2 μL，10×缓冲液2.5 μL，TaqDNA聚合酶1 U，无菌去离子水18.3 μL。PCR反应程序为94℃预变性5 min，94℃变性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，35个循环。TaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司，PCR反应在BIO-RAD PTC-200 PCR仪上完成。2.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，产物送武汉华大基因科技有限公司测序。

1.2.3 ELISA检测患者术前血清作为试验组，健康体检者血清作为对照组。收集相应患者术前和健康体检者静脉血液标本入凝血管，每人空腹抽血3 mL，室温静置凝血1～2 h，离心取血清-80℃保存。参照ELISA检测试剂盒（上海蓝基生物科技有限公司）说明进行操作，绘制标准曲线，计算出IL-12 p40和IL-12血清表达水平。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差（依s）表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

提取的组织基因组DNA经PCR，扩增出包含IL-12B 3′UTR+16974位点基因片段，约1024 bp。扩增产物送武汉华大基因科技有限公司测序，经BLAST比对，结果与人IL-12B基因序列有99%的同一性。

2.1 IL-12B 3′UTR+16974渊A/C冤位点多态性3种基因型频率分布

根据测序结果，癌组织和癌旁组织3种基因型频率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；将3种基因型分别进行比较，AA和AC基因型构成比、AC和CC基因型构成比差异有统计学意义（P＜0.05）；CC基因型在癌组织中频率明显较癌旁组织高。见表1。

表1 IL-12B 3′UTR+16974（A/C）位点多态性3种基因型频率分布［%（n1/n2）］

2.2 IL-12B 3′UTR+16974渊A/C冤位点多态性等位基因频率分布

癌组织A等位基因和C等位基因频率分别为30.77%（32/104）、69.23%（72/104），癌旁组织A等位基因和C等位基因频率分别为34.62%（36/104）、65.38%（68/104），差异无统计学意义（χ2=0.35，P=0.55）。

2.3 两组IL-12 p40和IL-12血清表达水平比较

试验组IL-12 p40和IL-12血清表达水平均明显高于对照组，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；试验组IL-12 p40和IL-12血清表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

3 讨论

IL-12主要通过Th1细胞间接发挥抗感染、抗肿瘤作用［5-6］。在某些疾病中可见IL-12 p40异常表达，如IL-12 p40在经典型霍奇金淋巴瘤组织中的表达量均明显高于弥漫性大B细胞淋巴瘤组织及反应性淋巴组织增生中的表达［7］。

图1 两组IL-12 p40和IL-12血清表达水平比较

近年发现某些疾病发生与IL-12B多态性有关。如IL-12B rs3212227基因多态性与卵巢癌的患病风险有关［8］；正常孕妇IL-12B基因启动子区存在多态性变异，其中-671G/T和-405G/T构成的单体型-671T/-405G可能与原因不明复发性流产的易感性有关［9］；IL-12B rs3212227基因多态性与广西地区人群原发性肝细胞肝癌有明显关联性［10］；IL-12B rs15677380和rs14050311基因多态性与肝硬化的发生存在关联［11］；IL-12B rs3212227多态性与原发性肝细胞肝癌发病风险的关系不密切［12］。

食管癌多态性方面仅有个别基因位点多态性的报道，如ERCC1基因C8092A位点在福建地区食管鳞状细胞癌患者中未见多态性表达［13］，食管癌患者血管紧张素转换酶基因多态性和ATM基因rs664143位点多态性与食管癌的发生有一定联系［14-15］。本研究通过直接对肿瘤组织DNA检测，发现IL-12B 3′UTR+16974位点CC基因型在食管癌组织中频率明显较癌旁组织高，提示CC基因型可能是食管癌的易感基因型，IL-12B 3′UTR+16974位点基因多态性与食管癌发病有关。

体外研究证实，转染IL-12基因的人脐带间充质干细胞对卵巢癌细胞的体外增殖和对裸鼠体内移植瘤有明显的抑制作用［16］；IL-12增强CIK细胞对食管癌EC9706细胞的杀伤活性［17］；小鼠骨髓间充质干细胞联合IL-12重组质粒在荷瘤小鼠体内联合应用可获得更强的抗肿瘤活性［18］。体内研究证实，IL-12血清表达水平在肿瘤早期、组织分化程度较高、没有转移的情况下表达量高于晚期及组织分化程度低和发生了远处转移的患者［19］。

本研究发现，试验组IL-12 p40和IL-12都异常高表达（P＜0.01），原因可能为试验组均是适宜做手术的患者，食管癌未处于晚期。推测其理论基础可能与机体发生细胞因子风暴有关，肿瘤发生时不断刺激机体分泌IL-12以此来达到抗肿瘤的目的［20-21］。但随着疾病恶化，免疫调节紊乱，机体抗肿瘤作用减弱，IL-12 p40和IL-12血清表达水平是否会出现降低，还有待进一步研究。

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Relationship between gene polymorphisms,serum expression level of IL-12B and esophageal cancer

PENG Lijuan1DU Jingwei2XU Jun3CHANG Jinxia1HU Weimin1PAN Wanlong1
1.Department of Microbiology and Immunology,North Sichuan Medical College,Sichuan Province,Nanchong637000, China;2.Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery,Central Hospital of Nanchong City,Sichuan Province, Nanchong637000,China;3.Department of Cardiothoracic Surgery,Central Hospital of Nanchong City,Sichuan Province,Nanchong637000,China

ObjectiveTo investigate relationship between interleukin(IL)-12B gene 3′untranslating region(UTR)+16974 (A/C)single nucleotide polymorphism,serum IL-12B level and esophageal cancer.Methods52 patients with esophageal cancer treated in Nanchong Central Hospital of Sichuan Province from June 2013 to June 2014 were randomly selected as experimental group.Esophageal carcinoma tissues and para-carcinoma tissues of 52 patients were collected after operation. DNA was extracted from these tissues.The genotype of the IL-12B 3′UTR+16974(A/C)polymorphisms were determined by polymerase chain reaction and sequencing.The patients with tumor tissues DNA were used as cancer tissues,and the adjacent 3-5 cm tissues were used as para-carcinoma tissues.The correlation between IL-12B gene polymorphism and tumor occurrence was analyzed.40 cases of healthy persons were selected as control group,at the same time,the serum of patients and healthy persons were collected.The serum expression level of IL-12 p40 and IL-12 were detected by enzymelinked immunosorbent assay.ResultsThe frequency of AA,AC and CC genotype in cancer tissues was 23.08%, 15.38%and 61.54%respectively,the frequency of AA,AC and CC genotype in para-carcinoma tissues was 15.38%, 38.46%and 46.15%respectively,with statistical difference(P＜0.05).The frequency of allele A and C in cancer tissues was 30.77%(32/104)and 69.23%(72/104)respectively,the frequency of allele A and C in para-carcinoma tissues was 34.62%(36/104),65.38%(68/104)respectively,there was no significant difference(P＞0.05).The serum expression levels of IL-12 p40 and IL-12 in experimental group were significantly higher than those in control group(P＜0.01).Con鄄clusionA/C polymorphism genotype CC of IL-12B 3′UTR+16974 site may be susceptible to esophageal cancer,the elevation of serum levels of IL-12 p40 and IL-12 are related to the occurrence of esophageal cancer.

Esophageal cancer;Interleukin-12;Interleukin-12B;Polymorphisms;Single nucleotide

R392.7

A

1673-7210（2015）12（a）-0020-04

2015-08-21本文编辑：李亚聪）

四川省教育厅自然科学类项目（15ZB0188）；四川省南充市科技局应用技术研究与开发资金项目（2010SF05）。

彭丽娟（1983-），女，硕士，从事医学微生物学和免疫学教学及科研工作。