西格列汀对肥胖大鼠血清及不同组织视黄醇结合蛋白4表达水平的影响

戚仁娟，胡红琳，夏 莉，刘炯炯，王长江，方朝晖

◇药学研究◇

西格列汀对肥胖大鼠血清及不同组织视黄醇结合蛋白4表达水平的影响

戚仁娟1，胡红琳1，夏 莉1，刘炯炯1，王长江1，方朝晖2

目的研究西格列汀对肥胖大鼠代谢指标、血清视黄醇结合蛋白4（RBP4）及附睾脂肪、肝脏组织RBP4表达水平的影响。方法 将40只SD大鼠随机分为对照组（ND组，n＝10）和高脂组（HD组，n＝30）。16周后HD组成功建立肥胖模型（n＝16），并随机分为肥胖对照组（OB组，n＝8）、西格列汀干预组（SITA组，n＝8）。分别测定干预前后体重（BW）、空腹血糖（FBG）、三酰甘油（TG）、胆固醇（TCH）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、空腹胰岛素（FINS）及血清RBP4水平，并计算胰岛素抵抗指数（HOMAIR）。Western blot法检测大鼠附睾脂肪和肝脏组织RBP4表达水平。结果①与ND组相比，HD组BW、FBG、TG、TCH、LDL-C、FINS、HOMA-IR、RBP4升高，HDL-C降低，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。在HD组中，OB组、SITA组间各指标差异无统计学意义。西格列汀干预后，SITA组较OB组FBG、TG、TCH、LDL-C、FINS、HOMA-IR、RBP4降低，HDL-C升高，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。②与ND组比较，OB组附睾脂肪RBP4蛋白表达水平显著增加（P＜0.05）；与OB组相比，SITA组附睾脂肪RBP4蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。③Pearson相关分析显示ND组、血清RBP4与TG呈正相关性；HD组、血清RBP4与FINS、HOMA-IR、TG、附睾脂肪RBP4呈正相关性，与HDL-C呈负相关性。结论 肥胖大鼠血清RBP4水平升高，附睾脂肪RBP4表达水平增高。西格列汀干预能显著降低肥胖大鼠血清RBP4水平及附睾脂肪中RBP4蛋白表达水平，并可改善糖脂代谢。

肥胖症；胰岛素抵抗；西格列汀；视黄醇结合蛋白4

脂肪组织不仅是能量储存器官，还是活跃的内分泌器官，可以分泌众多与代谢相关的脂肪因子，如内脏脂肪素、瘦素、视黄醇结合蛋白4（retinol binding protein 4，RBP4）等［1］。这些脂肪因子在肥胖患者胰岛素抵抗的发生与心血管并发症的发生中起重要作用。研究［2］表明，肥胖患者血清RBP4水平升高。目前，RBP4与肥胖的相关研究备受关注，但其在人体中的作用及其调节机制尚不明确。西格列汀作为二肽基肽酶-4（dipeptide peptidase-4，DPP-4）抑制剂，具有刺激胰岛β细胞再生、促进胰岛素分泌、抑制内源性葡萄糖的生成，达到降低血糖的作用，但西格列汀与肥胖患者RBP4的相关研究较少。该研究通过建立高脂饮食诱导的肥胖大鼠模型，给予西格列汀干预，测定肥胖大鼠干预前后血清RBP4水平及附睾脂肪、肝脏组织RBP4的表达水平，分析西格列汀干预对RBP4的可能作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及饲料40只普通级4周龄雄性SD大鼠，体重（body weight，BW）80～120 g，购自安徽医科大学实验动物中心。普通饲料由安徽医科大学实验动物中心配制，为国家标准龋齿类动物固体混合饲料。高脂饲料配方为普通饲料55%、猪油12%、蔗糖5%、奶粉8%、花生5%、鸡蛋10%、麻油3%、食盐2%。

1.2 实验试剂西格列汀（美国默沙东公司）；胰岛素放免试剂盒（北京原子高科公司）；RBP4酶免试剂盒（上海源叶生物科技有限公司）；稳豪血糖仪及试纸（美国强生公司）；RBP4一抗（英国Abcam公司）；RBP4二抗、β-actin一抗、β-actin二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3 动物分组及肥胖大鼠模型建立将40只大鼠予以普通饲料适应性喂养1周后，随机分为对照组（ND组，n＝10）予普通饲料喂养，高脂组（HD组，n＝30）予高脂饲料喂养。两组大鼠平行饲养，自由饮水，室温21～24℃，相对湿度40%～60%，自然昼夜节律。每2周称重1次，喂养16周后，取HD组BW大于ND组BW均数20%［3］的大鼠（n＝16）判定为肥胖造模成功的大鼠，将其随机分为肥胖对照组（OB组，n＝8）和西格列汀干预组（SITA组，n＝8）。

1.4 干预方法SITA组给予西格列汀灌胃10 mg／（kg·d），ND组和OB组均以等剂量生理盐水灌胃，共干预6周；干预期间ND组继续普通饮食，OB组和SITA组继续高脂饮食。

1.5 标本采集及检测16周末空腹状态下取内眦静脉窦血2 ml，静置15 min后，3 200 r／min离心10 min，血清放置于－80℃冰箱保存待测。22周末次干预后禁食12 h但不禁水，称重后水合氯醛0.3 ml／100 g腹腔注射，麻醉状态下打开腹腔，下腔静脉取血7 ml，静置15 min后，3 200 r／min离心10 min，血清放置于－80℃冰箱保存待测。麻醉状态下解剖大鼠，冰上操作取出附睾脂肪及肝脏组织，置于液氮罐中以备提取蛋白质。血糖仪纸片法测定血糖，Roche Modular全自动生化分析仪测定血脂，放免法测定胰岛素，ELISA法测定血清RBP4，采用胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment-insulin resistance index，HOMA-IR）模型公式［4］计算。HOMAIR＝空腹胰岛素（fasting insulin，FINS）（mIU／L）×空腹血糖（fast blood glucose，FBG）（mmol／L）／22.5。

1.6 Western blot法检测提取附睾脂肪中的总蛋白，使用BCA法测定蛋白浓度，根据蛋白浓度决定上样量。依次进行电泳、转膜、封闭，RBP4兔抗一抗（1∶500）4℃孵育过夜后，辣根酶标记的山羊抗兔二抗（1∶4 000）室温下孵育2 h。充分洗涤后加入ECL化学发光剂，暗室显影成像。检测后的膜重新用TBST清洗3次，TBS清洗1次（10 min／次），重复上述步骤进行内参照β-actin（一抗1∶1 000稀释，二抗1∶4 000稀释）的结合。采用上述相同方法，在相同条件下完成肝脏组织RBP4和对应的βactin蛋白检测。RBP4蛋白相对表达量以其特异性结合条带与β-actin结合条带的灰度值比值表示。

1.7 统计学处理采用SPSS 17.0软件进行分析，计量资料以±s表示。两组均数比较用配对t检验，3组均数间比较采用ANOVA及两两比较的LSD法；一个应变量与单个自变量之间的关系用Pearson相关性分析。

2 结果

2.1 干预前各组大鼠代谢指标比较与ND组相比，OB、SITA组大鼠BW、FBG、三酰甘油（triglyceride，TG）、胆固醇（total cholesterol，TCH）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL-C）、FINS、HOMAIR明显升高，高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL-C）降低，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；在HD组中，OB组、SITA组两组间各指标差异无统计学意义。见表1。

表1 干预前各组大鼠代谢指标的比较（±s）

表1 干预前各组大鼠代谢指标的比较（±s）

与ND组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

2.2 干预后各组大鼠代谢指标比较 西格列汀干预6周后，SITA组大鼠的FBG、TG、TCH、LDL-C、FINS、HOMA-IR下降，HDL-C升高，与OB组相比，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；与ND组相比，差异无统计学意义。西格列汀干预后，与OB组相比，SITA组大鼠BW有下降趋势，但差异无统计学意义。见表2。

表2 干预后各组大鼠代谢指标的比较（±s）

表2 干预后各组大鼠代谢指标的比较（±s）

与ND组比较：**P＜0.01；与OB组比较：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

2.3 干预前后各组大鼠血清RBP4水平比较干预前，HD组大鼠血清RBP4水平升高，与ND组相比，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；在HD组中，OB组、SITA组两组间比较差异无统计学意义。西格列汀干预后，SITA组血清RBP4水平下降，与干预前相比，差异有统计学意义（P＜0.05），与OB组相比，差异有统计学意义（P＜0.01），但仍高于ND组。见表3。

2.4 脂肪及肝脏组织中RBP4的表达与ND组相比，OB组附睾脂肪RBP4蛋白表达水平显著增加（P＜0.05）；与OB组相比，SITA组附睾脂肪RBP4蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。在肝脏组织中，3组RBP4表达差异无统计学意义。见图1。

表3 干预前后各组大鼠血清RBP4水平变化（±s）

表3 干预前后各组大鼠血清RBP4水平变化（±s）

与ND组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与OB组比较：＃＃P＜0.01

项目ND组（n＝10）OB组（n＝8）SITA组（n＝8）F值干预前（μmol／L）33.34±6.3541.42±4.70**39.86±5.62*5.265干预后（μmol／L）30.88±2.4042.52±6.34**35.04±2.61＃＃*18.338

2.5 血清RBP4与各指标间的相关性分析以ND组大鼠为研究对象，Pearson相关分析显示血清RBP4与TG呈正相关性，与其他指标无相关性。以HD组大鼠为研究对象，Pearson相关分析显示血清RBP4与FINS、HOMA-IR、TG、附睾脂肪RBP4呈正相关性，与HDL-C呈负相关性，与BW、FBG、TCH、LDL-C、肝脏RBP4均无相关性，见表4。

表4 RBP4与各指标间的相关性分析

3 讨论

RBP4是新近被发现的作用于肌肉和肝脏，并影响胰岛素敏感性的脂肪因子。RBP4主要由肝脏和脂肪组织合成，可以将视黄醇从肝脏转运至各种靶组织［5］。当RBP4在脂肪组织表达过多时可导致葡萄糖转运体4（glucose transport 4，GLUT4）表达下降，抑制肝脏和肌肉组织对葡萄糖的利用［6］。RBP4导致胰岛素抵抗的机制为RBP4水平升高可使肝脏产生过多的磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶，导致糖异生增加，并且通过IRS-1和PI3K途经导致肌肉组织胰岛素信号传导减弱［2，7－8］。

本研究显示高脂饮食诱导的肥胖大鼠血清RBP4水平及附睾脂肪RBP4表达水平较ND组升高，肝脏组织中RBP4表达量较ND组无明显改变，这提示RBP4虽然主要由肝脏和脂肪组织合成，但在肥胖状态下，血清中增高的RBP4水平可能主要来源于脂肪组织。Yang et al［2］发现在肥胖模型鼠中，脂肪组织RBP4表达水平明显增加，而肝脏组织RBP4表达水平不变，与本实验结果一致。Pearson相关性分析显示，在肥胖大鼠中，血清RBP4水平与HOMA-IR呈正相关性，与研究［7］结果一致。但Lewis et al［9］发现RBP4与胰岛素抵抗并无相关性，这可能与实验对象、样本含量及试验方法不同有关。同时本研究显示在肥胖大鼠中，血清RBP4与TG呈正相关性，与HDL-C呈负相关性，这与RBP4对肝脏的直接作用，导致肝脏产生TG过多，并促进极LDL-C释放入血有关［10］。

胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）是肠促胰素家族中的一员，具有促进胰岛素分泌，抑制胰高糖素释放，抑制胃排空，保护并增加胰岛β细胞数量，促进胰岛β细胞存活与生长、增殖与分化、抑制其凋亡等作用［11］。西格列汀作为DPP-4抑制剂，通过选择性抑制DPP-4活性，减少体内GLP-1降解，增加体内GLP-1浓度，促进胰岛素分泌、降低血糖、保护胰岛β细胞功能［12］。

目前关于西格列汀对肥胖大鼠RBP4蛋白表达有无影响的相关报道较少。本研究通过给予肥胖大鼠西格列汀干预6周来观察RBP4表达水平的变化，结果表明西格列汀干预后，血清RBP4水平及附睾脂肪RBP4表达水平下降，且糖脂代谢明显改善，与研究［4］结果类似。研究［13］显示另一种DPP-4抑制剂维格列汀亦能降低2型糖尿病患者血清RBP4水平，与本实验结果一致。西格列汀干预后，脂肪组织RBP4蛋白表达水平下降，而肝脏组织RBP4蛋白表达水平无明显改变，这与胰岛素增敏剂罗格列酮对GLUT4敲除鼠不同组织RBP4表达影响的研究［2］结果一致。西格列汀降低RBP4蛋白表达水平的机制目前尚不完全明确，可能为降低了FBG和胰岛素，改善胰岛素抵抗，RBP4适应性下调。另有研究［14］表明GLP-1干预后糖尿病模型鼠脂肪组织GLUT4表达水平增加，而RBP4水平与GLUT4水平呈负相关性［15］。随着GLUT4表达水平增加，RBP4表达水平下降，因此推测，西格列汀干预后RBP4表达水平下调与体内GLP-1浓度增加及GLUT4表达水平增加有关联。

综上所述，肥胖大鼠血清及附睾脂肪中RBP4水平升高，西格列汀干预后能显著降低肥胖大鼠血清及脂肪组织RBP4水平，并可改善糖脂代谢。RBP4作为新的脂肪因子，在肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病的发生发展过程中扮演着重要的角色。降低RBP4水平可能会成为肥胖症、2型糖尿病的治疗新靶点之一。

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Effects of treatment with sitagliptin on serum and different tissue retinol binding protein 4 expression levels in high-fat-fed obesity rats

Qi Renjuan，Hu Honglin，Xia Li，et al
（Dept of Endocrinology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo evaluate the effects of treatment with sitagliptin on metabolic parameters，serum retinol binding protein 4（RBP4）levels，epididymal adipose tissue and liver RBP4 expression levels in high-fat-fed obese rats.Methods40 SD rats were randomly divided into normal diet group（ND group，n＝10）and high fat dietgroup（HD group，n＝30）.16 weeks later，obese models（n＝16）were established from HD group and were randomly divided into obesity group（OB group，n＝8）and sitagliptin group（SITA group，n＝8）.Measure body weight（BW），fasting blood glucose（FBG），triglyceride（TG），total cholesterol（TCH），high-density lipoprotein（HDL-C），low-density lipoprotein（LDL-C），fasting insulin（FINS），serum RBP4 respectively before and after the 6 weeks of treatment，and calculate homeostasis model assessment-insulin resistance index（HOMA-IR）.Western blot was used to detect the epididymal adipose tissue and liver RBP4 protein expression levels.Results①The levels of BW，FBG，TG，TCH，LDL-C，FINS，HOMA-IR and serum RBP4 in HD group increased while the levels of HDL-C decreased compared with those of ND group with a statistical significance（P＜0.05，P＜0.01）.The differences between OB group and SITA group were of no statistical significance.After treatment with sitagliptin，the levels of FBG，TG，TCH，LDL-C，FINS，HOMA-IR and serum RBP4 of SITA group decreased while the levels of HDL-C increased compared with those of OB group with a statistical significance（P＜0.05，P＜0.01）.②Epididymal adipose tissue RBP4 protein expression levels in OB group increased compared with ND group（P＜0.05），epididymal adipose tissue RBP4 protein expression levels in SITA group decreased compared with OB group（P＜0.01）.③Pearson correlation analysis showed that in ND group，serum RBP4 was positively correlated with TG.In HD group，serum RBP4 and FINS，HOMA-IR，TG，epididymal adipose tissue RBP4 were positively correlated and negative correlation existed between serum RBP4 and HDL-C.ConclusionSerum and epididymal adipose tissue RBP4 protein levels are elevated in obesity rats.Sitagliptin intervention can lower serum and epididymal adipose tissue RBP4 protein levels in obesity rats and improve the glucose and lipid metabolism.

obesity；insulin resistance；sitagliptin；retinol binding protein 4

R 589.25

1000－1492（2015）02－0185－05

2014－09－20接收

安徽省高校省级自然科学研究项目（编号：KJ2013Z126）；安徽中医学院中医药管理局重点学科－中医内分泌学科开放基金（编号：2011nfmxk004）；国家自然科学基金青年科学基金培养计划（编号：2011KJ11）

1安徽医科大学第一附属医院内分泌科，合肥 2300222安徽中医药大学第一附属医院内分泌科，合肥 230031

戚仁娟，女，硕士研究生；王长江，男，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：chjw82＠126.com；夏 莉，女，主治医师，责任作者，E-mail：xiaLi0205＠163.com