神经干细胞移植治疗大鼠脑梗死的研究

神经干细胞移植治疗大鼠脑梗死的研究

脑梗死疾病是目前导致人类死亡和致残的主要疾病之一，梗死后神经功能的恢复始终是人们积极探索的目标［1］。干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的原始细胞，以干细胞移植治疗脑梗死成为当今探讨的热点［2］。因此，本实验将选取具有形成完整个体分化潜能的胚胎干细胞移植到脑梗死大鼠模型内，探讨其增殖、分化及疗效。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 DMEM/F12碱性成纤维生长因子bFGF、表皮生长因子EGF、2％B27、无钙镁PBS、Hank＇s液、4％多聚甲醛、兔抗大鼠nestin抗体、FITC标记的羊抗兔IgG、封闭用山羊血清、胎牛血清、抗5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）单克隆抗体。

1.2 实验动物及分组 孕龄15dSD大鼠供培养用；雄性SD大鼠，体质量200～250g，清洁级［由河南省实验动物中心提供，许可证号：SCXK（豫）2010—0002］，在标准饲养环境下自由食水，将大鼠随机分成2组，实验组25只，对照组25只，在造模成功后1d、3d、7d、14d、28d时间点进行神经功能学评分，28d评分结束后取5只行免疫组化荧光染色。

1.3 实验方法

1.3.1 脑梗死模型制作：脑梗死模型制作术前禁食12h，禁水4h，将大鼠麻醉，仰卧固定于无菌手术台上，颈部备皮消毒，于颈部正中行一约3cm切口，钝性分离颈前肌群，充分暴露颈动脉鞘后分离出右侧颈动脉分叉，将迷走神经完全从右侧颈总动脉、颈内、颈外动脉上游离，结扎颈外动脉，活结固定颈内、颈总动脉，在颈总动脉分叉处2mm颈外动脉处，使用眼科剪剪一小口，将标记后的线栓插入至大脑中动脉起始处，固定结扎线栓、消毒、缝合。2h后拔出线栓，实现再灌注，待大鼠苏醒后根据Zea-Longa 5分制评分标准筛选出成功脑梗死模型，评分2～3分的为动物模型成功，MCAO再灌24h行TTC染色，可见正常脑组织层深红色，梗死区呈白色，从病理上验证脑梗死模型成功。

1.3.2 神经干细胞的提取、培养及移植：（1）取孕龄15d的SD大鼠1只，麻醉后在无菌条件下取出胎鼠，分离胎鼠大脑皮质和海马区脑组织，收集滤液1 000r/min离心5min，去上清收集沉淀细胞，加DMFM/F12（含青链霉素，2％B27，20 μg/mL bFGF，20μg/mL EGF成分）无血清培养液，制成单细胞悬液，取5μL细胞悬液，加入5μL台盼蓝，于血球计数板上，倒置显微镜下计数，以5×106个/mL的密度接种于50 mL细胞培养瓶中，置于37℃，饱和湿度5％CO2的培养箱内培养。2～3d半量换液1次，每天进行倒置显微镜观察并拍照［3］。（2）神经干细胞的传代培养及诱导分化6～8d后对细胞进行传代，将细胞悬液计数并调整细胞密度为1×106个/mL，置于37℃，饱和湿度5％CO2的培养箱内继续培养。收集传代培养形成的神经细胞球，离心后加入含5％胎牛血清的DMEM/F12（1∶1）培养液，接种于用多聚赖氨酸（PLL）包被的盖玻片置于的6孔板中，置于37℃，饱和湿度5％CO2的培养箱内培养。对培养的NSCs进行nestin免疫荧光染色。将经Nestin染色阳性鉴定的细胞制成单细胞悬液，调整细胞密度为106个/μL，转移至EP管中作移植备用。（3）NSCs移植分别在大鼠脑梗死后1d、3d、7d、14d、28d经大鼠尾静脉进行神经干细胞移植，取1μL的细胞悬液进行缺血移植组移植，生理盐水对照组注射等量0.9％生理盐水。

1.3.3 神经干细胞移植后大鼠神经功能评分：移植后1d、3 d、7d、14d、28d5个时间点对各组大鼠进行Garcia 18分评分法，Garcia评分与脑梗死体积具有更好的相关性，更适合作为脑缺血治疗药物疗效评价的指标。评估各组大鼠的神经功能损伤程度，观察大鼠感觉、运动、反射及平衡能力进行评分。损伤最高为18分，无损害为0分。

1.3.4 NSCs移植后大鼠灌注取脑：分别于NSCs移植后1 d、3d、7d、14d、28d，每组分别取5只大鼠多聚甲醛灌注取脑，4℃的多聚甲醛溶液固定24h后依次放入15％、20％、30％的蔗糖中梯度脱水，每次24h。用OTC包埋脑组织后放入-24℃的冰冻切片机中，预冷20min后，冠状位冰冻切片，贴在载玻片上，每张厚度约为10μm，记录好序号及组号，放入防冻液中-20℃保存备用。

1.3.5 免疫组织化学染色：取制备好的切片放入4％多聚甲醛固定2h。山羊血清封闭液封闭30min，加1∶200兔抗人NSE多克隆抗体，1∶100兔抗鼠GFAP多克隆抗体和Brdu抗体盒，4℃过夜。PBS冲洗后，加入FITC标记的二抗（1∶100），37℃避光孵育40min，贴片后避光晾干，荧光猝灭剂封片，暗室荧光显微镜下观察梗死区边缘并计数阳性细胞数。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，2组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCs体外培养 孕龄15d胎鼠脑皮质海马组织，传代培养7d的细胞球，经免疫荧光染色以后Nestin表达阳性（图1），说明培养的细胞是神经干细胞。

2.2 移植后大鼠神经功能评分 缺血移植组大鼠的神经功能评分与对照组比较显著升高（P＜0.05），缺血移植组大鼠的神经功能评分在28d较14d时显著升高（P＜0.05）。见表1。

表1 2组神经功能评分比较（±s）

表1 2组神经功能评分比较（±s）

注：与对照组比较，＊P＜0.05；与1d、3d、7d、14d时比较，△P＜0.05

组别 n 1d 3d 7d 14d 28d对照组 5 5.0±1.321 6.5±1.112 6.8±1.430 10.5±1.540 11.8±0.848移植组 5 5.5±1.210＊6.8±1.330＊7.5±1.810＊12.8±1.352＊14.4±0.902＊△

2.3 Brdu染色 缺血移植组能够检测到BrdU阳性细胞，多为成簇分布（图2）。

2.4 GFAP染色 缺血移植组大鼠脑梗死边缘能够检测到GFAP阳性细胞，染色深，其突起多而细长（图3）。

3 讨论

脑梗死后中枢神经系统中脑神经组织损伤后是不可再生的，这对于治疗脑梗死后神经功能的恢复带来了一定的难度。研究表明，当活体神经系统受到损伤或刺激时，脑内神经干细胞能够自我增殖并参与神经再生和组织修复［4］。

本实验从孕15d胎鼠的大脑皮质和海马区脑组织中获取神经干细胞，在无血清培技术条件下分离、培养神经干细胞，经Nestin免疫荧光染色鉴定表达阳性，即神经干细胞，用培养得到的神经干细胞经大鼠尾静脉进行移植，结果表明体外培养的神经干细胞移植后能迁徙到缺血区域，分化为神经元细胞，并对移植组大鼠的肢体神经运动功能起到改善作用，这与Sakata等［5］的研究结果一致。同时，本实验也说明了移植的神经干细胞能够有效的穿透室管膜进入脑组织，具有进行细胞替代治疗的可能性。

在神经干细胞移植后14d、28d时缺血移植组大鼠神经功能评分与缺血对照组比较明显增高，并在移植后28d时神经功能评分明显高于14d，这说明移植的神经干细胞对脑梗死大鼠的神经功能恢复起到了持续、稳定的积极作用。在神经干细胞移植28d时可检测到BrdU阳性细胞聚集在缺血区周围，说明随着时间的推移，移植的神经干细胞逐渐向周围迁移、分化。GFAP染色显示大多数细胞阳性，证明其分化成了星形胶质细胞。星形胶质细胞的形成对损伤周围的神经细胞具有保护作用，有研究表明新生的星形胶质细胞不会抑制轴突的生长，会产生许多因子促进轴突的再生［6］。

综上所述，神经干细胞可以在移植后较长时间内持续存活下来，并在脑梗死灶周围迁移、分化，可能对脑梗死大鼠的神经功能修复起到积极的作用，且在实验中未发现肿瘤形成的证据。但大鼠毕竟只是实验动物，与人类差异很大，仍存在着大量的未知领域，需要对其进行更加深入的研究。

图1 神经干细胞

图2 神经干细胞的迁移、分化

图3 星形胶质细胞

［1］Sakata H，Narasimhan P，Niizuma K，et al.Interleukin 6-preconditioned neural stem cells reduce ischaemic injury in stroke mice［J］.Brain，2012，135（pt11）：3 298-3 310.

［2］Chang DJ，Oh SH，Lee N，et al.Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells（ENStem-A）migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats［J］.Exp Mol Med，2013，45：e53.

［3］刘磊，刘恒方，张敏，等 .胎鼠脑神经干细胞的分离、培养和鉴定［J］.江苏医药，2015，41（7）：753-755.

［4］Cheng Y，Zhang，Deng L，et al.Intravenously delivered neural stem cells migrate into ischemic brain，differentiate and improve functional recovery after transient ischemic stroke in adult rats［J］.Int J Clin Exp Pathol，2015，8（3）：2 928-2 936.

［5］Sakata H，Niizuma K，Yoshioka H，et al.Minocycline-Preconditioned Neural Stem Cells Enhance Neuroprotection after Ischemic Stroke in Rats［J］.J Neurosci，2012，32（10）：3 462-3 473.

［6］Hosseini SM，Farahmandnia M，Razi Z，et al.Combination Cell Therapy with Mesenchymal Stem Cells and Neural Stem Cells for Brain Stroke in Rats［J］.Intl J Cells，2015，8（1）：99-105.

（收稿2015-01-25）

张 敏1）刘 磊2）吴世陶1）赵源征1）石 磊1）郭亚培1）崔 明1）刘恒方1）△

郑州大学第五附属医院 1）神经内科 2）儿童康复医学科 郑州 450052

目的 探讨神经干细胞移植治疗大鼠脑梗死的可行性及疗效。方法 用线栓法将成年雄性大鼠制成大脑中动脉脑梗死模型，随机分为实验组和对照组各25只，实验组经尾静脉注射1μL神经干细胞悬液，对照组经尾静脉注射1μL生理盐水，在移植后1d、3d、7d、14d、28d依据Garcia的18分评分法对各组大鼠的神经功能进行评分。脑灌注固定取材，免疫组织化学染色法观察移植后神经干细胞的分化、迁移和整合情况。结果 移植后大鼠神经功能评分，实验组与对照组比较显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；实验组应用免疫组织化学染色法能够检测到存活的Brdu阳性细胞，可见干细胞参与梗死区边缘血管的增生。结论 移植体外培养的神经干细胞能在脑梗死大鼠脑内存活、迁移和分化，且对脑梗死大鼠的神经功能修复可能起到积极作用。

神经干细胞；移植；大鼠；脑梗死

The research of neural stem cells transplantation in the treatment of cerebral infarction in rats

Zhang Min＊，LiuLei，Wu S，hitao，Zhao Yuanzheng，ShiLei，Guo Yapei，Cui Ming，L，iu Hengfang，
＊Department of Neurologythe Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou UniversityZhengzhou450052China

Objective To investigate the feasibility and effects of neural stem cells transplantation in the treatment of cerebral infarction in rats.Methods The model of middle cerebral artery infarction was made of adult male rats with suture method，the successful models were randomly divided into experimental group and control group，25rats in each group.1μL neural stem cell suspension was injected via the tail vein in experimental group，rats in the control group received the injection of 1μL physiological saline via the tail vein.Nerve function of rats in each group was assessed after 1-，3-，14-，and 28-day transplantation according to the Garcia scores with 18points.Brain materials were fixed by cerebral perfusion，and the differentiation，migration and integration of neural stem cells were observed by immunohistochemical staining.Results After transplantation，nerve function scores of the experimental group were significantly higher than that of the control group，the difference was statistically significant（P＜0.05）.The alive Brdu cells were detected by immunohistochemistry staining in the experimental group，which revealed that the nerve stem cells could be involved in the proliferation of marginal vessels in the infarct area.Conclusion Transplantation of vitro-cultured neural stem cells can survive，migrate and differentiate in rats with cerebral infarction，which may play apositive role in the rehabilitation of neurological function in cerebral infarction rats.

Nerve stem cells；Transplantation；Rats；Cerebral infarction

R-332

A

1673-5110（2015）21-0011-03

河南省教育厅科学技术研究重点项目（12A320064）

△通讯作者：刘恒方，E-mail：liuhf1965＠163.com