蝎毒活性肽对同型半胱氨酸致血管内皮细胞损伤的差异蛋白表达谱的影响

周 莉， 宋益民 ， 唐学玺

(1. 中国海洋大学生命学院，山东 青岛266003;2. 青岛科技大学制药工程系，山东 青岛266042)

全蝎是我国传统的中药材，有息风止痉、通经活络、消肿止痛、攻毒散结等功效，能治疗风湿痹痛、半身不遂、中风、瘰疬、无名肿痛、癌症、顽固性皮肤病、肾炎、血管硬化、乙肝、脉管炎、血栓闭塞等，其有效药用成分是蝎毒，迄今为止，从蝎毒中可鉴定出的活性多肽和酶多达几十种，但在医药上真正具有确切疗效的多肽仅限于抗栓肽、抗癫痫肽、镇痛肽和抗肿瘤肽等几种成分［1-2］。蝎毒活 性 肽 (scorpion venom bioactive polypeptide，SVAP)是我室首次报道的从东亚钳蝎蝎毒中分离出的一种分子量为7.2 kDa 具有明显抗栓作用的活性成分，以往的研究工作证明SVAP 抗栓机制可能与影响血管内皮细胞分泌组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、纤溶酶原激活剂抑制物(PAI)，前列环素(PGI2)、NO，纠正PGI2/TXA2失调，提高血栓调节蛋白(TM)mRNA 表达水平，稳定血管内环境，扩张血管，抗血小板聚集、降低血液黏滞度和改善微循环有关［2-6］，但SVAP 抗栓的血管内皮细胞介导蛋白分子机制尚不清楚。本研究针对高浓度(超生理剂量)同型半胱氨酸(Hyperhomocysteine，HHcy)对血管内皮细胞(vascular endothelial cell，VEC)损伤这一血栓形成的关键环节，从VEC 损伤相关蛋白表达的变化与SVAP 干预等方面进行研究，利用蛋白质组学技术，通过比较给药前后VEC 蛋白表达的整体改变，对该细胞蛋白质组学方法条件进行优化，找出可能介导SVAP 抗栓作用的生物分子、作用靶点，旨在阐明HHcy 引起VEC 损伤致血栓形成的蛋白表达谱的变化及SVAP防治VEC 损伤、抗血栓形成的蛋白水平分子机制，并在一定程度上为临床应用SVAP 防治心脑血管血栓栓塞性疾病提供药效学物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料 新生儿脐带取自正常分娩或剖宫产胎儿;24 孔塑料细胞培养板，25 cm2培养瓶(美国Costar 公司产品);M199 (美国Gibcobrl 公司产品);内皮细胞生长因子(德国Boehringer Mannheim 产品);1 ∶250 胰酶(北京华美公司产品);M199 培养基(美国Gibco 公司产品);胎牛血清(杭州四季青公司产品);L-谷氨酰胺(美国Sigma公司产品);青霉素(新华鲁抗药业集团有限公司产品);链霉素(华北制药华胜有限公司产品)。固相pH 梯度(immobiline pH gradient，IPG)干胶条(pH 3 ～10 NL，24 cm)、IPG buffer、尿素、三羟甲基胺基甲烷(Tris)、丙烯酰胺、亚甲基双丙烯酰胺、蛋白质相对分子量标记物、甘油、十二烷基磺酸钠(SDS)溴酚蓝购自美国GE Healthcare公司;DBP (分析纯，比重l g/mL)、硫脲、3-［(3-胆酰胺丙基)-二乙胺］-丙磺酸(CHAPS)、RNA 酶和DNA 酶、碘乙酰胺(IAA)和甲醛购自美国Sigma 公司;考马斯亮蓝G250、硫代硫酸钠、低熔点琼脂糖购自美国Amresco 公司;二硫苏糖醇(DTT)购自上海生工生物工程股份有限公司;胰蛋白酶购自美国Promega 公司;多肽校正标准和基质(α-HCCA)购自德国Bruker 公司。

1.2 仪器 IPGphorTM 等电聚焦仪、Hoeter SE600垂直电泳系统、ImageMasterTM2D Platinum software(美国Amersham Pharmacia 公司)，Umax image scanner (Umax 公司)，基质辅助激光解析电离化/飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)购自德国Bruker公司。CO2培养箱 (美国Format Scientific Co 产品);Multiscan 酶标仪(日本Epson 公司产品);倒置相差显微镜(中国上海显微镜厂产品);MDF-35 型冷冻干燥机(日本宫川资材株式会社产品);高速冷冻离心机(日本HITACHI 公司产品);FA 2004 型电子天平(上海天平仪器厂产品)。

1.3 药物制备 SVAP 由本室自制，PBS 溶解后，经脱盐、浓缩、真空冷冻干燥，用无胎牛血清的血管内皮细胞培养液配成一定浓度的溶液，微孔滤膜过滤除菌，-20 ℃储存备用。

1.4 脐静脉内皮细胞培养 在无菌条件下取产后新鲜脐带10 ～15 cm，参考文献［7］并加以改良，用酶消化法分离脐静脉内皮细胞(HUVEC)，置于25 cm2培养瓶中，在湿润培养箱中(37 ℃，5%CO2)进行培养，培养液为含200 mL/L 胎牛血清(SCS)、2 mmol/L 谷氨酰胺、50 mg/L 内皮细胞生长因子、5 μ/mL 肝素的M199，经3 ～4 d 待细胞融合成单层，按1 ∶2 比例传代培养，经细胞形态学观察和鉴定，倒置显微镜下观察可见HUVEC贴壁生长、呈铺石样镶嵌排列，细胞为扁平多角型，核为圆形或椭圆形。试验所用细胞为2 至3 代。

1.5 蛋白样品制备与含有量测定 收集生长良好的对数生长期的HUVEC 传代接种入75 cm2培养瓶中，待细胞80%以上融合后，将细胞分为3 组，即空白对照组、HHcy、HHcy + SVAP 处理组。处理组加入终浓度为500 μmol/L 的HHcy 和10 mg/L SVAP，而空白对照组细胞不做任何处理继续培养6 h，加胰酶消化，吹打，离心收集细胞，用PBS洗涤细胞2 次，加入蛋白质酶抑制剂和细胞裂解液(40 mmol/L Tris、4% CHAPS、8 mol/L 尿素)，液氮冻融3 次，加入RNA 酶和DNA 酶消化核酸，高速离心(16 000 r/min，30 min)收集上清液，得到细胞总蛋白质，蛋白质定量采用Bradford 法。

1.6 双向电泳 分别取空白对照组、HHcy、HHcy+SVAP 组细胞的等量蛋白质(1 mg)，参考文献［8］ 并加以改良，用水化液(8 mol/L 尿素，2% CHAPS，13 mmol/L DTT，0.5% IPG buffer，0.002%溴酚蓝)定容到450 μL，制成第一向等电聚焦体系，采用胶内泡涨的方法上样，20 个样品被加到6 条pH 3 ～10 的非线性胶条中，等电聚焦的参数:30 V 12 h;500 V 1 h;1 000 V 1 h;8 000 V 8 h，等电聚集后，胶条于平衡液1 (1%DTT，50 mmol/L Tris-HCl，6 mol/L 尿素，30% 甘油，2% SDS，0.002%溴酚蓝)、平衡液2 (4% 碘乙酰氨，50 mmol/L Tris-HCl，6 mol/L 尿素，30%甘油，2% SDS，0.002%溴酚蓝)中各平衡15 min，然后转移到第二向已制好的12.5% SDS 胶上，用0.5%琼脂糖封顶，进行第二向电泳，电泳参数设定为30 W 45 min;90 W 6 h，直到溴酚蓝染料迁移至胶的底部边缘，结束电泳。

1.7 图像分析 考马斯亮蓝染色6 h，脱色12 h。Image Scanner 扫描仪扫描染色凝胶后，利用Imagemaster 2D Elite 4101 图像分析软件分析电泳图谱。3 次提取的3 组蛋白质，分别进行3 次二向电泳，图像分析时将HHcy 处理组的凝胶作为参考胶分别与对照组和HHcy +SVAP 组胶相匹配，蛋白点归一化定量后输出数据到Excel 进行统计分析。

1.8 酶切和质谱分析 选取3 次重复2D 胶上均存在，且差异明显、无明显拖尾、且完全分离的点，用刀片沿斑点染色边缘切下蛋白点，将蛋白胶粒均匀切碎，置于1.5 mL Ep 离心管中，用去离子水清洗2 次，加脱色液(25 mmol/L 碳酸氢铵和50%乙腈)100 μL，摇床震荡20 min，弃去溶液，重复3 次，直至胶片中蓝色脱尽，加纯乙腈脱水，真空离心干燥。加10 μL 胰酶，4 ℃保温18 h，加入5%三氟乙酸120 μL 于37 ℃保温1 h，吸出上清液，加入2.5%三氟乙酸和50%乙腈溶液120 μL于30 ℃保温1 h，合并上清液冷冻干燥。用5 μL 0.1%三氟乙酸溶解样品，与1 μL 基质(α-腈基-4-羟基肉桂酸溶于0.1%三氟乙酸/50%乙腈的饱和溶液)充分混匀后，取1 μL 于不锈钢点靶仪上点样，风干后进行质谱分析。

1.9 数据库查询 将获得的肽质量指纹谱(由军事医学科学院生物医学分析中心完成)运用Mascot 软件搜索Swissport (http:∥www. matrixscience.com)和NCBInr (http//www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/edd/wrpsb. cgi)数据库，对质谱分析鉴定的差异表达蛋白进行结构域分析。

1.10 Western blot 制备SDS-PAGE 凝胶，β-actin为内参，每个样品蛋白上样量为60 μg。在浓缩胶中电泳用80 V 电压，分离胶则用120 V 电压，至溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳。电转法4 ℃下恒流250 mA 转膜1.5 h，将目的蛋白条带从凝胶转移到PVDF 膜上，脱脂奶粉封闭液中封闭1 h，加一抗(1 ∶1 000 锰超氧化物歧化酶抗体;1 ∶10 000 β-actin 抗体)4 ℃孵育过夜。用TBST 洗膜3 次，每次5 min，加二抗室温孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min，化学发光显色，照相。Tanon 2500 凝胶成像分析系统上摄像并对目的蛋白条带与内参灰度值的比值进行统计分析。

1.11 统计学方法 采用SPSS 13.0 软件进行统计分析。实验数据以±s 表示。

2 结果

2.1 HHcy 损伤血管内皮细胞蛋白表达谱的变化提取血管内皮细胞蛋白，对空白对照组、HHcy、HHcy+SVAP 组内皮细胞蛋白进行双向电泳，其代表性考马斯亮蓝染色电泳图谱见图1，Imagemaster 2D Elite 4101 软件分析结果表明，平均每块凝胶上可找到600 个左右蛋白点，以空白对照组中一块凝胶作参照，其蛋白点匹配率为89%，HHcy 组蛋白点匹配率为87%，HHcy +SVAP 组匹配率为86%，说明具良好的重复性。

2.2 差异蛋白点的质谱分析 选取有明显改变(差异4 倍以上)的蛋白点，胶内酶切提取蛋白进行质谱分析，与空白对照组比，HHcy 组发现有1个蛋白点上调及11 个蛋白点下调，这些蛋白涉及氧化应激、细胞凋亡、核酸、糖、蛋白质、脂肪代谢及能量代谢等生物学过程。与HHcy 组比较，SVAP 可调节锰超氧化物歧化酶、网钙蛋白1 前体和钙网蛋白前体的蛋白表达。其中锰超氧化物歧化酶、网钙蛋白1 前体的表达上调，钙网蛋白前体的表达下调。见图2 ～4、表1。

图1 体外培养血管内皮细胞双向电泳图谱Fig.1 2D maps of proteins from normal，HHcy and HHcy+SVAP treated HUVECS

表1 差异蛋白点基质辅助激光解析电离化/飞行时间质谱鉴定结果Tab.1 Indentification results of different protein spots by MALDI-TOF-MS

图2 体外培养血管内皮细胞锰超氧化物歧化酶蛋白表达的变化Fig.2 Changes of superoxide dismutase ［Mn］protein expression in HUVEGs in vitro

3 讨论

图3 体外培养血管内皮细胞网钙蛋白1 前体蛋白表达的变化Fig.3 Changes of reticulocalbin 1 precursor protein expression in HUVECs in vitor

心脑血管血栓栓塞性疾病发病率甚高，研究其防治措施为世人所瞩目。目前，抗栓或溶栓治疗被视为有效的防治手段，但目前临床推荐使用的抗血栓药物对心脑血管疾病有很好的防治效果，但不良反应明显，限制了其在临床上长期反复使用，如常用的溶栓药链激酶易引起出血，而t-PA 及其突变体价格昂贵，病人又难以承受。以血管内皮细胞为作用靶点的抗栓药不同于传统的抗血栓药物，既不直接影响凝血系统和血小板功能，也不是直接的溶栓作用。通过调节内皮细胞功能，达到抗血栓目标，是目前抗血栓药物研究发展的方向。

SVAP 是具有明显抗栓作用的从蝎毒中分离纯化的一种活性成分，以往的研究工作证明SVAP 抗栓机制可能与影响血管内皮细胞分泌t-PA、PAI、PGI2、NO，纠正PGI2/TXA2失调，提高TM mRNA表达水平，稳定血管内环境，扩张血管，抗血小板聚集、降低血液黏滞度和改善微循环有关［2-6］，但SVAP 抗栓的血管内皮细胞介导蛋白分子机制尚不清楚。

本实验应用2-DE 结合MALDI-TOF-MS 技术，分析了体外培养空白对照组与HHcy 组内皮细胞蛋白的表达差异，发现其中存在12 种差异蛋白，其功能涉及氧化应激、细胞凋亡、糖、蛋白质、脂肪代谢及能量代谢等生物学过程。表明氧化应激和细胞凋亡与血管内皮细胞损伤密切相关。本实验进一步研究了SVAP 对空白对照组与HHcy 组差异表达蛋白的调节作用，探索SVAP 改善血管内皮细胞氧化应激和细胞凋亡等作用，结果表明，SVAP 可调节锰超氧化物歧化酶、网钙蛋白1 前体和钙网蛋白前体的蛋白表达。其中锰超氧化物歧化酶、网钙蛋白1 前体的表达上调，钙网蛋白前体的表达下调。且Western blot 与MALDI-TOF-MS 研究结果相一致。

目前，国内外相关领域众多学者［9-10］普遍认为机体内存在两类抗氧化防御系统，包括酶系和非酶系抗氧化防御系统，正常状态下内源性的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)可被这两类氧化系统清除，ROS 的产生和清除处于动态平衡，酶抗氧化系统主要有锰超氧化物歧化酶、血红蛋白过氧化物酶、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)等，锰超氧化物歧化酶能催化生物体内多余的并对细胞有害的超氧自由基转化为过氧化氢和氧气，过氧化氢随后被体内的过氧化氢酶和过氧化物酶分解为H2O 和O2，从而解除O-2所造成的氧化胁迫。实验结果显示，与空白对照组相比，HHcy 中锰超氧化物歧化酶的表达量较低，机体产生的ROS 不能及时得到分解，造成机体氧自由基平衡失调，推测可能是HHcy 状态下，血管内皮细胞酶抗氧化系统调节能力降低，引起氧化应激从而造成内皮损伤。同时SVAP 能够显著升高HHcy 血管内皮细胞锰超氧化酶歧化酶的量，显著增强抗氧化能力，调节抗氧化应激酶的量，表明SVAP 可能通过增强抗氧化系统调节能力而抗氧化应激，从而改善血管内皮细胞功能。

钙网蛋白前体是一种多功能蛋白质，主要存在于细胞内质网的内腔和细胞核内，作为一种主要的钙离子结合(储备)蛋白又称钙结合蛋白3。钙网蛋白前体的氨基端可与糖皮质激素受体的DNA 结合区域结合从而抑制糖皮质激素受体与糖皮质激素结合而发挥作用，因此可以认为钙网蛋白前体是控制核激素受体基因的一个重要调质，钙网蛋白前体与血管内皮细胞损伤的的关系未见文献报道［11-12］。本研究证明HHcy 组钙网蛋白前体的表达上调，我们推测糖皮质激素的大部分作用是由存在于细胞浆内的糖皮质激素受体介导，经细胞内信号转导从而改变靶基因的表达来实现的。糖皮质激素的靶细胞广泛分布于全身器官组织细胞中。它可通过增加脂皮质素1 (lipocortin 1)的生成继之抑制磷酯酶A2(PLA2)活性而抑制炎症介质白三烯(LTs)、前列腺素(PGs)及血小板活化因子(PAF)的生成。糖皮质激素还能诱导血管紧张素转化酶合成，促进可引起血管舒张和致痛的缓激肽降解，此外糖皮质激素还能诱导炎细胞凋亡，从而产生抗炎作用。而LTs、PGs、PLA2、PAF 和炎细胞等在高同型半胱氨酸引起的血管内皮细胞的炎性损伤形成中都起到促进作用，所以根据以上糖皮质激素的特性，可能钙网蛋白前体在抑制糖皮质激素受体与糖皮质激素结合的同时，进而间接上调了LTs、PGs、PLA2、PAF 的活性和增加了血管内皮炎细胞浸润，从而间接地促进了血管内皮细胞损伤的形成。

本实验结果显示HHcy 组钙网蛋白前体表达量与空白对照组比较显著提高，而HHcy +SVAP 组与空白对照组比无统计学差异，可见，在SVAP 处理组，钙网蛋白前体表达量下调，导致糖皮质激素受体与糖皮质激素结合作用增强，抑制了炎症因子的产生，从而缓解了血管内皮细胞损伤的形成。总之，SVAP 对血管内皮细胞损伤的保护作用可能与其调节钙网蛋白前体表达有关，至于详细机制尚不清楚，为此在今后的研究中我们将针对钙网蛋白前体与SVAP、血管内皮细胞损伤进行具体系统的研究。

［1］ Zhou X H，Liu C M. Purification of nine kinds of toxic peptides from Buthus Martensii Karsch of Chinese［J］. Acta Biochim et Biophys Sin，1988，20(1):68-75.

［2］ Song Y M，Tang X X，Chen X G，et al. Effects of scorpon venom active peptides on platelet aggregation and thrombosis and plasma 6-keto-PGF1αand TXB2in rabbits and rats［J］. Toxicon，2005，46(2):230-235.

［3］ 宋益民，李学坤，周 莉，等. 蝎毒活性肽对内皮细胞释放t-PA 和PAI 的影响［J］. 中国药理学通报，2001，17(5):594-595.

［4］ 宋益民，许兰芝，李学坤，等. 蝎毒活性多肽对内皮细胞释放PGI2和NO 的影响［J］. 中国临床药理学与治疗学，2001，6(4):350-352.

［5］ 宋益民，李学坤，周 莉，等. 蝎毒活性多肽对大鼠肠系膜微循环的影响［J］. 微循环学杂志，2002，12(2):15-16.

［6］ 宋益民，李学坤，王锡岭，等. 蝎毒活性肽对兔血液流变性的影响［J］. 中国血液流变学杂志，2002，12(3):185-187.

［7］ Jaffe E A，Nachman R L，Becker C G，et al. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins［J］. J C1in Invest，1973，52(11):2745-2756.

［8］ Karp N A，Kreil D P，Lilley K S. Determining a significant change in protein expression with DeCyder during a pair-wise comparison using twodimensional difference gel electrophoresis［J］. Proteomics ，2004，4(5):1421-1432.

［9］ Cai H，Harrison D G. Endothelial dysfunction in cardiovascular diseases:the role of oxidant stress［J］. Circ Res，2000，87(10):840-844.

［10］ Puddu P，Puddu G M，Cravero E，et al. The molecular sources of reactive oxygen species in hypertension［J］. Blood Press，2008，17(2):70-77.

［11］ Watanabe S，Yamakami J，Tsuchiya M，et al. Antiinflammatory effect of theophylline in rats and its involvement of the glucocorticoid receptor system［J］. J Pharmacol Sci，2008，106(4):566-570.

［12］ Lo wenberg M，Stahn C，Hommes D W，et al. Novel insights into mechanisms of glucocorticoid action and the development of new glucocorticoid receptor ligands［J］. Steroids，2008，73(9-10):1025-1029.