补阳还五汤对大鼠肌源性干细胞体外生长分化的影响

郭占鹏， 刘 堃， 黄米娜， 王岩松， 袁亚江， 郭 跃， 刘安琪， 梅晰凡*

(1. 辽宁医学院附属第一医院，辽宁 锦州121001;2. 辽宁医学院护理学院，辽宁锦州121001;3. 辽宁医学院，辽宁锦州121001)

在以往的研究中发现肌源性干细胞有向软骨细胞、神经细胞、肌肉细胞分化的潜能［1-2］。相关研究和临床实践证明，补阳还五汤可以改善脊髓损伤后大鼠的功能［3］。因此推断是否补阳还五汤具有通过调节微环境促进多潜能干细胞向神经细胞分化的可能。据此将体外培养的肌源性干细胞分为对照组及补阳还五汤含药血清组，研究补阳还五汤对肌源性干细胞体外生长分化的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 清洁级SD 大鼠，体质量(100 ±5)g，雌雄不限，随机分为对照血清组和药物血清组，各30 只。所有大鼠均由辽宁医学院动物实验中心提供(许可证号SCXK ［辽］2003-2007)。

1.1.2 试验试剂及仪器 补阳还五汤由黄芪、当归、赤芍、地龙、川芎、红花、桃仁(饮片)组成，各成分比例为20 ∶3 ∶3 ∶3 ∶3 ∶2 ∶3。生药由辽宁医学院附属第一医院药剂科一次性购买后水煎2 次，合药后浓缩至0.8 g/mL，过滤除菌后分袋包装，冷冻保存备用。Ⅱ型胶原酶(Sigma);Ⅱ型分散酶(Sigma);高糖DMEM 培养基(Gibco 公司);兔抗大鼠Desmin、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体购自北京中杉金桥公司。

1.2 实验方法

1.2.1 含药血清制备 药物血清组大鼠每日灌服浓缩中药汤剂4 mL/次，药物剂量按照3 g/kg (剂量按照成人体表面积的2 倍计算)，早晚各1 次，连续给药3 d，对照血清组每天灌服相同剂量生理盐水。末次给药4 ～6 h 内采尾血2 mL，静置3 h 后离心分离血清，56 ℃灭活30 min，-20 ℃冷冻备用。

1.2.2 原代MDSCs 的分离纯化培养 无菌条件下取新生1 ～3 d 的SD 乳鼠四肢肌肉组织，剔除脂肪、肌腱等组织后应用混合酶(含有Ⅱ型胶原酶2 g/L、Ⅱ型分散酶4.8 g/L、CaCl20.28 g)消化约60 min 后终止消化，经过滤离心后去上清，加入DMEM 培养液重悬细胞，移入培养瓶中，采用差速贴壁法分离纯化肌源性干细胞，细胞在达到约70% ～80%汇合时传代培养。

取传代后生长状态良好的细胞，载入24 孔板(约1 ×104细胞)，随机分为2 组(对照血清组和含药血清组)，每组10 孔，每孔加入培养液1 mL，37 ℃、5% CO2温箱中培养7 d。倒置相差显微镜下观察2 组细胞形态变化。

1.2.3 免疫荧光法检测 在含有细胞悬液的培养皿中放入盖玻片，将培养皿放入5%CO2培养箱，每天换液，培养2 ～3 d，多聚甲醛(4%)固定25 ～30 min;Triton -100(0.3%)作用5 min，H2O2(3%)作用20 ～30 min;加封闭液20 min，去除多余液体，不需漂洗，滴加一抗4 ℃过夜;继续滴加二抗(1 ∶100 稀释)作用2 h;SABC 30 min;DAB 试剂盒显色作用30 min;苏木素染色0.5 min;梯度酒精(75% →85% →95% →100%)脱水，脱水时间4 min/次。二甲苯Ⅰ滴定10 min，二甲苯Ⅱ滴定10 min。缓冲甘油封片，无荧光指甲油封4 周。

1.2.4 Western blot 检测蛋白表达 采集肌源性干细胞和分化的神经样细胞，采用2 ∶1 的裂解液 (RIPA + 1%PMSF)裂解充分，4 ℃条件下12 000 r/min 离心20 min。以牛血清白蛋白(BSA)为对照 品，用BCA 法测定蛋白质含有量，按得出的蛋白量(蛋白样品TBS、RSB)加入无菌EP 管，加样，沸水煮4 min，降温后放入-20 ℃冰箱，保存试验备用。

采用经典SDS-PAGE 法(12%)分离蛋白质，每个点样孔的蛋白上样量为20 μg。凝胶电泳结束后将PAGE 胶体中的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，将膜放入3%(m/V)BSA 阻断缓冲液中，封闭条件60 min，用TBS 缓冲液(10 mmol/L Tris (pH 8.0)、150 mmol/L NaCl)洗膜3次，清洗条件10 min/次。将膜放入兔抗大鼠Hes1 一抗中(抗体1 ∶500 稀释)，4 ℃过夜。TTBS (含0.05% Tween 20)缓冲液低温冲洗3 次后，室温条件下将膜放入含有辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG 二抗中孵育1 ～2 h，继续用TTBS［1 L TBS 缓冲液中加入0.5 mL Tween 20 (0.05%)］洗膜3 次，清洗条件5 min/次，TTBS 冲洗后，将膜放入二抗中，室温摇床上孵育1 h，再用TTBS 洗膜3 次/5 min 后，倒掉洗膜液，甩去多余液体，转膜时与胶相邻的一面向上铺于玻璃板上。将ECL 试剂盒内的detection reagent 1 与detection reagent 2 等体积混合后，均匀滴在PVDF 膜上，反应1 ～2 min，上机检测。

表达相对水平=［(实测灰度值/β -actin)/(对照组灰度值/β-actin)的均数］×100%

2 结果

2.1 细胞形态学观察 培养7 d 后，两组细胞均贴壁生长，状态良好。对照血清组细胞与分离纯化后细胞相似，多数呈纺锤状或梭形生长。含药血清组细胞胞浆出现长突起，类似神经细胞的神经突起，细胞突起间相互融合，但是并未出现典型的神经球(图1)。

图1 细胞形态学观察

2.2 免疫荧光检测 NSE 和GFAP 在对照血清组细胞胞浆内可见少量表达，而其在含药血清组细胞内可见高表达(图2)。

图2 免疫荧光检测图

结果可知，NSE 在对照血清组细胞胞浆可见少量表达;NSE 在含药血清组细胞内可见高表达;GFAP 在对照血清组细胞胞浆可见少量表达;GFAP 在含药血清组细胞内可见高表达(×400)。

2.3 蛋白表达水平分析 NSE 和GFAP 蛋白在对照血清组细胞内可见少量表达，而其在含药血清组细胞内可见强表达，二者均具有统计学差异(P ＜0.05)(图3)。

图3 NSE 和GFAP 蛋白在对照血清组和含药血清组细胞中表达水平变化

3 讨论

根据脊髓损伤后出现的症状与中医古籍中对“体惰、痿病”的描述相类似。督脉受损则经气不通、气血阻滞，导致阳气不能通达四肢，从而出现肢体麻木、瘫痪、二便失禁等经络不通的现象;同时督脉贯脊、络肾，故督脉受损必伤及肾。补阳还五汤是由黄芪、当归、赤芍、地龙、川芎、红花、桃仁熬制而成的汤药。黄芪意在大补元气、使气旺血行，赤芍、桃红活血化瘀，地龙、川芎通络止痉，当归补血活血［4］。研究表明:补阳还五汤对脊髓缺血再灌注损伤有保护作用，其可能抑制神经细胞的凋亡［5］。另有研究发现:补阳还五汤能够促进大鼠脊髓损伤后移植的胚胎神经干细胞存活、增殖和迁移［6］。大量的研究均表明补阳还五汤对脊髓损伤修复具有一定的积极作用，而经过研究发现肌源性干细胞(muscle derived stem cells，MDSCs)，又称为群旁细胞(side populations，SP)，具有多向分化潜能，良好的增殖和自我更新能力，体外分化为神经细胞、骨细胞、平滑肌细胞［7-11］等系的细胞，能够实现离体分离、培养及扩增，且来源丰富、方便，具有良好的免疫反应调节能力。郭占鹏等［12-13］通过实验证明肌源性干细胞在一定作用下可体外诱导分化为神经样细胞。因此本次研究侧重于通过实验观察补阳还五汤对大鼠肌源性干细胞体外生长分化的影响。

神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)被视为经典的神经内分泌细胞的标记［14］。本次研究通过对含药血清组和对照组两组中NSE、GFAP 的表达进行比对分析，发现药物血清组的细胞可见多边形改变类似神经样突起，对照组细胞呈纺锤状;药物血清组中细胞的NSE 和GFAP 的表达均明显高于对照组(P ＜0.05)。通过实验观察到含药血清组使肌源性干细胞向神经样细胞分化，其细胞形态改变出现类似神经样突起，而对照组无此变化。因此认为补阳还五汤对大鼠肌源性干细胞体外生长分化具有一定促进作用，能够在一定程度上促进肌源性干细胞的分化。

本实验采用补阳还五汤对肌源性干细胞进行体外诱导分化成神经样细胞，获得了满意的分化效果，充分说明补阳还五汤作为中药汤剂在适当的条件下是可以促进体内神经样细胞的形成，这也为脊髓损伤细胞移植中药辅助治疗提供了一定理论基础。但由于中药汤剂成分比较复杂，其具体作用机制尚需进一步探讨。

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