过表达D5 Stat5a促进前列腺癌细胞增殖及IGFBP-7基因启动子组蛋白甲基化

聂玺 张洁 余超 谭敦勇

吉首大学医学院生物化学与免疫学系，湖南吉首416000

过表达D5 Stat5a促进前列腺癌细胞增殖及IGFBP-7基因启动子组蛋白甲基化

聂玺 张洁 余超 谭敦勇

吉首大学医学院生物化学与免疫学系，湖南吉首416000

目的探讨D5 Stat5a对人类前列腺癌细胞增殖的影响及其对胰岛素样生长因子结合蛋白7（IGFBP-7）表达的影响。方法常规培养人前列腺癌细胞（DU145及PC3），并随机分为四组：对照组及三个实验组。对照组以不含外源基因的腺病毒感染，三个实验组细胞则以携带D5 Stat5a cDNA的腺病毒感染，其病毒感染增殖活性（MOI）依次为10、20及30。四组细胞均在培养液中加入催乳素（50 ng/mL）以启动细胞信号转导。运用MTS方法检测细胞增殖；实时定量PCR检测抑癌基因IGFBP-7及EZH2 mRNA水平；染色质免疫共沉淀技术（ChIP）检测IGFBP-7基因启动子区域组蛋白甲基化程度；蛋白质印迹法检测IGFBP-7蛋白表达。结果携带D5 Stat5a cDNA的腺病毒感染能够呈剂量依赖式地促进前列腺癌细胞（DU145及PC3）增殖。如PC3细胞，对照组细胞的相对活细胞数为（1.362±0.018），三个实验组相对活细胞数分别为（1.453±0.022）（P＞0.05）、（1.649±0.020）（P＜0.05）及（1.829± 0.027）（P＜0.05）。实时定量PCR及蛋白印迹证明D5 Stat5a过表达明显下调IGFBP-7的表达。DU145及PC3对照组细胞IGFBP-7 mRNA相对值分别为（0.796±0.023）及（0.871±0.046），而感染携带D5 Stat5a cDNA的腺病毒（MOI 30）后，其IGFBP-7 mRNA相对值则分别下降到（0.148±0.019）（P＜0.01）及（0.078±0.021）（P＜0.01）。染色质免疫共沉淀分析（ChIP-Assay）证实，D5 Stat5a导致IGFBP-7基因启动子区域组蛋白甲基化（H3K27Me3）水平显著上升。DU145细胞对照组与实验组，其沉淀DNA比例分别为（0.0176±0.0030）%及（0.0650±0.0099）%，两者差异有高度统计学意义（P＜0.01）。此外，实时定量PCR检测表明，D5 Stat5a引起组蛋白甲基转移酶EZH2 mRNA大幅上升。DU145细胞对照组及D5 Stat5a感染组相对mRNA水平分别为（0.0033±0.0004）及（0.0160±0.0035），两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论转录因子D5 Stat5a能够显著促进人类前列腺癌细胞的增殖，其主要的表观遗传学机制在于D5 Stat5a增加EZH2基因表达，导致抑癌基因IGFBP-7启动子区域组蛋白甲基化，使启动子活性降低，IGFBP-7表达下降，是导致前列腺癌细胞的异常增殖分子机制之一。

D5 Stat5a；前列腺癌细胞；表观遗传学；组蛋白甲基化；染色质免疫共沉淀

转录因子Stat5（signal transduction and activation of transcription 5）是催乳素、生长因子以及一系列细胞因子信号通路的重要环节［1-2］，在乳腺以及前列腺的发育、分化［3-4］等生理活动中起着极为重要的作用。Stat5基因表达异常会导致乳腺以及前列腺发育以及生殖功能障碍等一系列病理过程的出现［5］。Stat5包括Stat5a及Stat5b两种，两者高度同源，且作用相近，由两个独立基因编码［6］。有人推测，Stat5a及Stat5b基因由同一个组基因复制而来［6］。有证据表明，Stat5的异常表达可能参与了某些生殖肿瘤尤其是乳腺癌及前列腺癌等的病理过程［7］。但有关Stat5在肿瘤如乳腺癌及前列腺癌形成、发展及预后中的确切作用，目前尚无定论，且有关此方面的报道，多相互矛盾。Sultan等［8］曾检测人类乳腺癌组织中Stat5a的表达，结果发现，Stat5a的表达量与患者的预后有密切关系，Stat5a表达量越高预后越好。而更多的研究则表明，Stat5作为一种病理因素参与了前列腺癌及乳腺癌的发病过程［9］。

D5 Stat5a是最近自人前列腺腺癌细胞及乳腺癌细胞所克隆的Stat5a的一种变体［10-11］，因其N-端30个氨基酸丢失且对应于此30个氨基酸的基因DNA恰好为Stat5a基因的第5个外显子（90个碱基对），因而将此变体命名为Delta 5 Stat5a或简称D5 Stat5a。笔者以前的工作已经证明，该变体在生物学特性上与全长的Stat5a有共同点，例如作为转录因子，依然能够响应相应的配体如催乳素所启动的细胞信号，进而二聚化并完成核转位，最后与相应的DNA位点结合。但除此之外，此变体在生物学功能上却有着极为重要的区别，主要表现D5 Stat5a能够与不同的其他转录因子交互作用，并显著促进某些癌细胞如乳腺癌及前列腺癌细胞的增殖及去分化。D5 Stat5a在人类乳腺癌组织及前列腺癌细胞有异常表达［10］，意味着D5 Stat5a可能是前列腺癌、乳腺癌得以形成的一种重要的病理因素。胰岛素样生长因子结合蛋白-7（insulin-likegrowth factor 7，IGFBP-7）与胰岛素样生长因子受体具有很强的结合活性，能够阻挡胰岛素样生长因子（IGF）与其受体的结合，因而IGFBP-7能够抑制胰岛素样生长因子的活性［12］，进而调节细胞的增殖、凋亡等过程［13］。有报道表明，IGFBP-7对肿瘤细胞的增殖有抑制作用［13-14］。本研究除了检测及确认D5 Stat5a对培养状态的人类前列腺癌细胞DU145及PC3增殖的影响外，利用实时定量PCR、蛋白印迹（Western blot）及染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）分析等方法，分析高表达D5 Stat5a对胰岛素样生长因子结合蛋白7（IGFBP-7）基因表达的影响以及其启动子区域表观遗传学修饰的改变（组蛋白甲基化），以期阐明D5 Stat5a与前列腺癌的病理联系及其可能的表观遗传学机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂

人类前列腺癌细胞DU145、PC3（中南大学细胞库）、RPMI 1640培养液（美国Gibco公司）、抗H3K27Me3抗体（美国Millimore公司）、抗IGFBP-7抗体（美国Santa Cruz生物公司）、细菌蛋白G磁珠（美国Invitro gen公司）、细胞增殖分析试剂MTS［3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2H-tetrazolium］以及蛋白印迹显影试剂ECL（Enhanced chemiluminescent substrate）（美国Promega公司）。

1.2 携带D5 Stat5a cDNA腺病毒制作

为提高基因转移效率，本研究采用腺病毒基因转移法，其制作方法依据Stratagene公司建议的制作程序。基本步骤：①将D5 Stat5a cDNA克隆至穿梭载体（pShuttle-IRES-hrGFP-1）；②利用同源重组原理将穿梭载体的D5 Stat5a cDNA上传到腺病毒基因组（Ad5），该病毒基因组经人工改造去掉其与病毒复制有关的E1及E2序列；③确认重组成功后，将其转入经特殊处理的细菌株（XL10-GoldR）大量扩增（重组体在该细菌内只能扩增但不能再发生新的重组以保证重组的准确及稳定）；④提取重组体，以限制性内切酶PacⅠ进行酶切处理以暴露其末端反向重复序列（invert terminal repeat，ITR），然后将其转入AD-293细胞，使其包装成有活性的病毒；⑤病毒活性（滴度）以病毒感染AD-293细胞后形成病毒斑块的能力（plaque forming unit，PFU）表示，而PFU总数与待感染的细胞总数之比值即为病毒感染增殖活性（multiplicity of infection，MOI）。

1.3 细胞培养、腺病毒介导的基因转移及活细胞计数（MTS法）

人类前列腺癌细胞（DU145、PC3）用RPMI 1640培养液（含10%胎牛血清）在37℃、5%CO2培养箱中培养。当细胞的贴壁密度或贴壁面积为70%时，弃去培养液，用含0.5%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养细胞24 h（细胞处于饥饿状态）以使所有细胞均处于G0期后，换为正常培养液，当细胞贴壁密度达到70%后，细胞（DU145及PC3）随机分为四组：对照组及三个实验组。对照组以不含外源基因的腺病毒感染，三个实验组细胞则以携带D5 Stat5a cDNA的腺病毒感染，其病毒MOI依次为10、20及30。病毒感染120 min后，换为正常培养液，四组细胞均在培养液中加入催乳素（50 ng/mL）以启动细胞信号转导（细胞增殖实验时四组之外另设一组对照细胞，不加催乳素）。继续培养48 h后，加入MTS试剂并测定其波长为492 nm的吸光值，得到相对活细胞计数。

1.4 染色质免疫共沉淀分析（ChIP Assay）

人类前列腺癌细胞（DU145、PC3）经病毒感染处理后，吸弃培养液，并以冰冷的PBS（phosphate buffer solution）缓冲液洗3次，继之：①以新鲜配制的1%甲醛固定，10 min后，以甘氨酸终止甲醛活性；②吸弃甲醛固定液，以细胞收集液（100 mmol/L Tris-Cl，pH 9.4，10 mmol/L DTT）收集细胞，冰冷PBS缓冲液洗细胞3次，加入细胞裂解液（1%SDS，10 mmol/L EDTA，pH 8.0，50 mmol/L Tris-Cl，pH 8.1，1×蛋白酶抑制剂），并以超声粉碎仪破碎基因组DNA至500 bp左右片段；③以ChIP稀释液（1%Triton X-100，2 mmol/L EDTA，150 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-Cl，pH 8.1，1×蛋白酶抑制剂）1∶10稀释；④加入抗H3K27Me3抗体，4℃轻摇过夜（与此同时，另设一平行管，加入IgG以得到非特异性结合的数据）；⑤以含细菌蛋白G的磁珠沉淀；⑥以洗脱液（1%SDS，TE缓冲液配制）将DNA-H3K27Me3-抗体复合物自磁珠上洗脱；⑦65℃过夜以解除固定，继之用蛋白酶H消化蛋白（抗体）；⑧纯化DNA；⑨实时定量PCR检测、确认被抗H3K27Me3抗体沉淀的DNA中是否含有IGFBP-7基因启动子区域DNA序列及含量。

1.5 实时定量PCR（quantitativerealtimepolymerasechain reaction，qRT-PCR）

本研究中使用实时定量PCR有两个目的，一是染色质免疫共沉淀后，需要确认被沉淀的DNA序列；二是检测IGFBP-7基因的表达状况。其操作步骤依照公司说明书进行：①引物设计，本研究的PCR引物包括用于检测染色质免疫共沉淀后DNA的引物（对应于IGFBP-7基因启动子序列进行设计）以及用于检测IGFBP-7及EZH2 mRNA的引物，见表1；②底物为SYNR Green；③PCR参数，变性95°C 1 min，退火55℃，30 s，延伸72℃，30 s，收集40个循环的荧光强度，并得到相应的Ct值；④ChIP DNA的相对量以未经免疫沉淀时DNA中所含IGFBP-7基因DNA量（Input）为参照，计算其被沉淀的IGFBP-7启动子序列DNA占Input的百分数。IGFBP-7 mRNA的相对量则以管家基因18 SrRNA为对照计算。具体计算方法如下：相对mRNA量=（每个样本的18S rRNA的Ct值-每个样本的IGFBP-7的Ct值）2。

1.6 蛋白质印迹（Western Blot）法

人前列腺癌细胞（PC3）经携带D5 Stat5a cDNA的腺病毒感染后，吸弃培养液，并经冰冷PBS洗3次，收集细胞并加入细胞裂解液（RIPA），12 000 r/min离心，收集上清，测定蛋白浓度，然后进行下述步骤：①电泳分离：样本加入上样液并经煮沸5 min变性，每孔上样20 μg，100V电泳90 min；②转膜：应用半干转膜装置（Bio-Rad）7 V转膜45 min；③抗原抗体反应：上述经蛋白转移后的硝酸纤维素膜，经PBST（phosphate buffered saline tween 20）洗3次（每次10 min）并经非特异位点封闭后，加入抗IGFBP-7抗体，4℃过夜，第2天进行二抗反应；④显影：运用ECL试剂并经X光片记录发光强度及位置。

1.7 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差表示，本实验所测得数据呈正态分布者被视为有效数据，组间比较采用配对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 D5 Stat5a对人类前列腺癌细胞增殖的影响

对照组细胞，分别给予或不给予催乳素（50 ng/mL）处理，结果显示给予催乳素处理后，相较于没有给予催乳素处理的细胞，其细胞增殖略显增加，但两者之间的活细胞计数差异无统计学意义（P＞0.05）。三个实验组细胞，则由于感染不同剂量（MOI 10、20及30）的腺病毒（携带D5 Stat5a cDNA），在加入催乳素的情况下，其活细胞计数呈剂量依赖式增加。DU145及PC3细胞，D5 Stat5a均有促进其增殖的作用。PC3细胞对照组（加入催乳素）相对活细胞计数为（1.362± 0.018），当MOI分别为10、20及30时，其活细胞相对计数分别为（1.453±0.022）（P＞0.05）、（1.649±0.020）（P＜0.05）及（1.829±0.027）（P＜0.05）；DU145细胞，对照组相对活细胞计数为（1.339±0.0233），当MOI分别为10、20及30时，其活细胞相对计数分别为（1.391±0.018）（P＞0.05），（1.629±0.030）（P＜0.05）及（1.755±0.026）（P＜0.01）。见图1。

2.2 D5 Stat5a过表达对IGFBP-7基因表达的影响

运用qRT-PCR及Western blot方法检测了DU145及PC3细胞的IGFBP-7 mRNA水平以及PC3细胞的IGFBP-7蛋白水平。结果如图2A所示，DU145及PC3细胞在转入含有D5 Stat5a cDNA的腺病毒后，IGFBP-7 mRNA下降明显，当细胞分别感染携带D5 Stat5a cDNA病毒MOI 10、20及30后，DU145细胞IGFBP-7 mRNA相对值由对照细胞的（0.796±0.023）减少至（0.752±0.068）（P＞0.05）、（0.534±0.007）（P＜0.05）及（0.148±0.019）（P＜0.01）；PC3细胞IGFBP-7 mRNA相对值由对照细胞的（0.871±0.046）减少至（0.690±0.047）（P＞0.05）、（0.472±0.075）（P＜0.01）及（0.078±0.021）（P＜0.01）。与之相应，PC3细胞中IGFBP-7蛋白水平，在D5 Stat5a作用下亦出现下降（图2B），对照细胞IGFBP-7蛋白相对值为（1151.387±55.909），当感染病毒MOI 10、20及30时，其IGFBP-7蛋白相对值分别为（1035.863± 36.028）（P＞0.05）、（798.233±71.806）（P＞0.05）及（283.577±35.715）（P＜0.01）。

2.3 D5 Stat5a对前列腺癌细胞IGFBP-7基因启动子组蛋白甲基化的影响

如结果“2.1”所示，过量表达Stat5a能够显著促进培养状态的前列腺癌细胞的增殖。IGFBP-7是细胞周期的关键调控因子之一，有报道表明，前列腺癌组织IGFBP-7表达往往出现异常（降低）。笔者推测，D5 Stat5a促进前列腺癌细胞增殖可能与改变IGFBP-7基因的表达有关。本研究a在探讨D5 Stat5a能否改变IGFBP-7基因启动子区域的表观遗传学。本研究检测了组蛋白3的第27位赖氨酸的甲基化程度（H3K27Me3），前列腺癌细胞（DU145及PC3）经不含（Con）或含有D5 Stat5a cDNA的腺病毒（D5）转染后，沿染色质免疫共沉淀途径固定细胞、超声得到500 bp左右染色质DNA片段，以抗H3K27Me3抗体沉淀后，得到相应DNA片段，最终以实时定量PCR探测IGFBP-7启动子区域DNA片段。结果表明，过量表达D5 Stat5a的细胞，其染色质沉淀中含有大量被抗H3K27Me3沉淀的DNA片段。如图3所示，DU145细胞对照组与实验组，其沉淀DNA比例分别为（0.0176± 0.0030）%及（0.0650±0.0099）%，两组比较差异有高度统计学意义（P＜0.01）；PC3细胞对照组与实验组，其沉淀DNA比例分别为（0.0142±0.0009）%及（0.0480± 0.0036）%，两组比较差异有高度统计学意义（P＜0.01）；说明D5 Stat5a能够导致IGFBP-7启动子区域的H3K27的三甲基化。实验中，本研究还使用了非特异性IgG抗体进行沉淀，结果表明，所有组别的DNA沉淀比例均低于0.005%，表明染色质免疫共沉淀是特异的。此外，为消除引物对基因组DNA的非特异性结合的影响，还运用了非特异性无关引物进行检测，结果表明，无关引物并没有探测到明显的被沉淀的DNA片段，所有组别的DNA沉淀比例均低于0.005%（P＜0.01），说明染色质沉淀是基因特异的。

2.4 D5 Stat5a过表达上调EZH2基因表达

EZH2（Enhancer of Zesste Homology 2）是一种组蛋白赖氨酸N甲基转移酶，主要作用于核小体组蛋白3的27位赖氨酸残基（H3K27），导致3个甲基集团转移至H3K27（H3K27Me3），因而EZH2是导致H3K27Me3形成的关键因素。在结果“2.3”所示实验的基础上，进一步检测了前列腺癌细胞过表达D5 Stat5a之后对EZH2表达的影响。结果显示，D5 Stat5a能够显著上调EZH2 mRNA水平，DU145细胞对照组及D5 Stat5a感染组（MOI 30）其相对mRNA水平分别为（0.0033± 0.0004）及（0.0160±0.0035），两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。PC3细胞分别为（0.0038±0.0014）及（0.0200±0.0021），两组比较差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见图4。提示D5 Stat5a首先通过提升EZH2基因表达水平，继而导致IGFBP-7基因启动子区域组蛋白的甲基化。

3 讨论

关于转录因子Stat5a在生殖系统肿瘤形成中的作用，是近十年来研究人员关注的焦点之一［15］，有关Stat5在乳腺癌及前列腺癌的形成、发展及预后方面的真正作用，目前尚无定论。尽管已经有不少报道，将Stat5的表达与生殖系统癌症联系起来，但从报道的结果看，往往相互矛盾。Sultan等［8］报道表明，Stat5a的含量越高癌症患者（例如乳腺癌）的预后越好，说明Stat5a是一种抑癌因素。也有报道表明，Stat5a作为一种病理因素参与了肿瘤（如乳腺癌）的形成和发展［9］。D5 Stat5a的发现为解决这一矛盾提供了新的思路，笔者以前的工作已经证明，作为转录因子，D5 Stat5a与全长的Stat5a一样，能够在相应细胞信号的作用下，完成二聚化及核转移，并与相应的靶基因启动子区域结合启动基因转录，但D5 Stat5a其N'-端30个氨基酸的丢失又导致了D5 Stat5a与全长的Stat5a具有不同的功能［10-11］。主要表现在D5 Stat5a对人乳腺癌细胞（MCF-7及T47D）以及前列腺癌细胞（DU145）的增殖有较强的刺激作用，而全长的Stat5a无此作用。同时，由于全长的Stat5a及D5 Stat5a两者只相差30个氨基酸，两者的分子量相差很小（一为94 kD，一为92 kD），一般的Western blot很难将其分离，这也就是为什么D5 Stat5a没有被更早发现的原因之一。因而前述笔者报道的有关Stat5a的作用可能实际上包含Stat5a及D5 Stat5a两种分子的作用，这也部分解释了出现矛盾结果的原因。

本研究采用腺病毒介导的基因转移法使前列腺癌细胞得以过量表达Stat5a。根据以前的经验，在基因转染过程中，若采用化学转移法（如使用lipofectamine等试剂转染），人类乳腺癌细胞（T47D、MCF-7）及前列腺癌细胞的转移效率较低（低于50%），因而影响试验结果。本研究采用腺病毒介导的基因转移法，理论上，转移效率可以达到90%以上。本研究首先检测了过量表达D5 Stat5a后对细胞增殖的影响。结果表明，过量表达D5 Stat5a之后，DU145及PC3的细胞密度，显著上升，且呈剂量依赖关系。此外，由于催乳素是Stat5a及D5 Stat5a的有效激活剂，本研究设置了两组对照，两组对照均以不携带D5 Stat5a cDNA的腺病毒（空病毒）进行转染，其中一组细胞不加入催乳素，而另一组对照则加入催乳素以激活D5 Stat5a。结果发现，加入催乳素的对照组，虽然没有过量表达外源D5 Stat5a，但细胞密度亦有少量增加，应为催乳素刺激激活内源性D5 Stat5a所致（肿瘤细胞在自然状态下亦可生成D5 Stat5a）。根据本研究结果认为，至少在细胞增殖方面，D5 Stat5a所起作用为病理性的。

IGFBP-7能够有效影响IGF与其相应受体的结合，是调控细胞增殖的因素之一［16］，其表达与肿瘤的发生、发展及预后有一定的关系［11］。多数学者认为，IGFBP-7属于抑癌因素，其基因属于抑癌基因［17］。为阐明D5 Stat5a的促进细胞增殖作用是否与IGFBP-7有关，本研究运用qRT-PCR及Western blot法对过表达D5 Stat5a的前列腺癌细胞IGFBP-7 mRNA及蛋白表达水平进行了检测，结果如预期，过量表达D5 Stat5a能够显著下调IGFBP-7的mRNA及蛋白水平。这一结果提示D5 Stat5a促进前列腺癌细胞及乳腺癌细胞（笔者以前的实验结果）的增殖，其途径之一是抑制抑癌基因IGFBP-7的表达。

为探讨D5 Stat5a如何抑制IGFBP-7基因的表达，本实验运用染色质免疫共沉淀法，对过量表达D5 Stat5a后的前列腺癌细胞IGFBP-7基因启动子区域的表观遗传学修饰进行了检测。在携带D5 Stat5a cDNA的腺病毒转染，并经1%甲醛固定后，DU145及PC3染色质DNA经超声粉碎至500 bp左右的片段，以抗H3K27Me3抗体对DNA片段进行沉淀。结果表明，IGFBP-7基因启动子区域DNA被大量沉淀，说明过量表达D5 Stat5a能够促进IGFBP-7基因启动子区域H3K27Me3修饰。H3K27Me3对基因组DNA与组蛋白的相互作用具有非常直接的影响。大量研究表明，这一修饰能够严重干扰与转录有关的蛋白质因子进入基因启动子区域，从而抑制基因的转录表达［18］。由此，笔者确认上述D5 Stat5a抑制IGFBP-7表达，是由于D5 Stat5a导致了IGFBP-7基因启动子区域H3K27Me3，从而封闭IGFBP-7基因启动子所致。此外，如结果图3所示，在对照组DU145及PC3细胞，与使用抗IgG的非特异性抗体相比，使用抗H3K27Me3抗体，沉淀后其所含IGFBP-7基因启动子片断较多，推测导致这一现象的原因，可能是前列腺癌细胞实际上在D5 Stat5a作用前，已经存在IGFBP-7基因启动子H3K27Me3现象。

由于H3K27Me3主要由另一种甲基转移酶EZH2介导，本实验还检测了D5 Stat5a对前列腺癌细胞EZH2表达（mRNA）的影响。如结果图4所示，虽然在无外源D5 Stat5a转入（对照）的情况下，EZH2亦有一定的表达（这符合EZH2通常在癌细胞表达的现象），但D5 Stat5a的过表达能够显著上调EZH2表达水平，是对照细胞EZH2 mRNA水平的2倍以上。

综上所述，D5 Stat5a确有促进前列腺癌细胞（DU145、PC3）增殖的作用，其分子机制之一是通过刺激EZH2的表达，改变IGFBP-7启动子区域的组蛋白表观遗传学修饰，促进H3K27Me3，从而抑制IGFBP-7基因的表达。结合以前的工作，笔者推测，D5 Stat5a的高表达可能是促进前列腺癌形成的因素之一。有关D5 Stat5a的作用机制，依然存在大量工作需要完成，许多问题有待进一步回答，例如导致EZH2基因表达上调的分子机制如何？D5 Stat5a可否作为未来治疗生殖系统肿瘤的靶点？这些都有待进一步深入探讨。

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Over-expression of D5 Stat5a induces proliferation of human prostate cancer cells and histone trimethylation of IGFBP-7 promoter region

NIE XiZHANG JieYU ChaoTAN Dunyong
Department of Biochemistry&Immunology,Jishou University College of Medicine,Hu'nan Province,Jishou416000, China

ObjectiveTo clarify the effect of D5 Stat5a on the proliferation of prostate cancer cells and the expression of insulin-like growth factor binding protein 7(IGFBP-7).MethodsProstate cancer cells(DU145 and PC3)were randomly divided into four groups:control and three experimental groups.The cells were infected with adenovirus carrying or not carrying(Con)D5 Stat5a cDNA at MOI 10,20 and 30 respectively for 120 min and cultured in the presence of prolactin(50 ng/mL)for further 48 h.The relative viable cell number was determined by MTS assay.Quantitative real time polymerase chain reaction(qRT-PCR)and Western blot were used to examine the expression of IGFBP-7. Chromatin immunoprecipitation(ChIP)assay was also applied to examine the effect of D5 Stat5a on the trimethylation of histone 3 of IGFBP-7 gene promoter region.ResultsAdenovirus(carrying D5 Stat5a)infection induced proliferation of prostate cancer cells in a dose-dependant manner.Taking PC3 as example,therelative viable cell number was(1.362±0.018)in control cells,while infection with adenovirus carrying D5 Stat5a cDNA at MOI 10,20 or 30 increased the relative vialble cell number to(1.453±0.022)(P＞0.05),(1.649±0.020)(P＜0.05) and(1.829±0.027)(P＜0.05),respectively.qRT-PCR showed that the relative IGFBP-7 mRNA amounts were(0.796± 0.023)and(0.871±0.046)in DU145 and PC3 control cells respectively,however,they decreased to(0.148±0.019)(P＜0.01)and(0.078±0.021)(P＜0.01)in DU145 and PC3 cells infected with virus carrying D5 Stat5a cDNA at MOI 30, respectively.Increased trimethylation on histone 3 lysine 27(H3K27Me3)of IGFBP-7 gene promoter region and downregulated IGFBP-7 expression were also found in prostate cancer cells over-expressing D5 Stat5a including DU145 and PC3 cells.ChIP assay showed that the percentage of immunoprecipitated DNA in control cells and cells infected with D5 Stat5a cDNA adenovirus at MOI 30 were(0.0176±0.0030)%and(0.0650±0.0099)%(P＜0.01)respectively in DU145 cells.Additionally,over-expression of D5 Stat5a up-regulates the expression of EZH2.The relative EZH2 mRNA in control cells and cells(DU145)infected with virus carrying D5 Stat5a at MOI 30 were(0.0033±0.0004)and (0.0160±0.0035)(P＜0.05),respectively.ConclusionD5 Stat5a promotes proliferation of prostate cancer cells through, at least partly,up-regulation of EZH2 expression followed by trimethylation of H3K27(H3K27Me3)and inhibition IGFBP-7 gene expression,which is one of the molecular mechanism of abnormal proliferation of prostate cancer cells.

D5 Stat5a;Prostate cancer cells;Epigenetics;Histone trimethylation;Chromatin immuneprecipitation assay

RQ7；R73［

］A［

］1673-7210（2015）04（a）-0007-07

2014-11-24本文编辑：程铭）

国家自然科学基金资助项目（编号81172497，81260396）。

聂玺（1981.8-），女，吉首大学医学院2014级生物化学与分子生物学专业在读硕士研究生；研究方向：乳腺癌的分子机制。

［作者简介］谭敦勇（1958.2-），男，医学博士，教授，美国心脏病学会会员及美国内分泌学会会员；研究方向：生殖系统肿瘤的分子生物学。