抗菌肽的功能及生产研究进展

刘伦伦，刘 焱1， *，瞿朝霞，罗 灿

（1.湖南农业大学 食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128；2.湖南农业大学 食品科技学院，湖南 长沙 410128）

抗菌肽（antibacterial peptides，ABP）是具有抗菌活性的肽类的总称，抗菌肽不但具有广谱的抗菌活性，而且还有抗癌、抗病毒、抗寄生虫、促进伤口愈合等作用，具有较大的药用开发价值。天然抗菌肽通常是由12～100多个氨基酸残基组成的碱性小分子多肽，水溶性好，有典型的两亲结构，分子质量大约4～10 ku。在近几年中，抗菌肽逐渐成为免疫学、细胞生物学和分子生物学等领域的研究热点，有望开发为新一代肽类抗菌、抗癌等药物的来源。因此，为更好地了解抗菌肽的研究进展和促进抗菌肽的生产应用，本文对抗菌肽的功能，纯化鉴定方法，人工合成和基因工程表达进行了综述，以期为抗菌肽的纯化鉴定、生产和应用提供理论依据。

1 抗菌肽的功能及作用机理

1.1 抗菌肽的抗菌功能

抗菌肽具有广谱的抗菌活性，大部分抗菌肽能够抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌生长，其中还有一些具有抗真菌的效果。DE LATOUR F A等[1]从眼镜蛇中提取的抗菌肽对大肠杆菌（Escherichia coli）具有抑菌活性；DOSLER S等[2]研究表明抗菌肽对绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）的抗菌效果显著且能抑制绿脓杆菌生物膜的形成，相比抗生素不易产生耐药性，不同抗菌肽之间以及抗菌肽和抗生素可通过协同作用，提高抗菌效果。HWANG B等[3]从柑橘凤蝶中提取的柑橘凤蝶抗菌肽（papiliocin）通过调节活性氧和羟自由基的积累控制白色念珠菌（Candida albicans）的凋亡。OUELLET M等[4]研究了分别由14个氨基酸和21个氨基酸组成的具有两亲性的合成抗菌肽，这两种抗菌肽都含有亮氨酸和苯丙氨酸，但作用机理有所不同，由14个氨基酸组成的抗菌肽充当细胞膜扰乱器的角色，引发钙离子和钠离子等的泄漏，而由21个氨基酸组成的抗菌肽主要是作为离子通道，且酰基链的长度和序列对抗菌活性都有影响。可以看出，不同抗菌肽的抗菌作用方式并不完全相同。到目前为止，抗菌肽的抗菌机理还不是很明确，主要被接受的理论是抗菌肽在静电作用下吸附到病原微生物细胞膜的表面，改变了细胞膜的结构，使得细胞内容物泄漏出来，从而起到了杀菌作用。

1.2 抗菌肽的抗癌功能

抗菌肽除了能抑制病原微生物生长外，其抗癌活性也是研究的一个重点。CHEN H M等[5]合成的肽CA，CB，CB-1和CB-2不仅对大肠杆菌（E.coli）、肺炎杆菌（pneumobacillus）和绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）有抗菌活性，且CB-1和CB-2对HL-60血癌细胞（HL-60 leukemia）的抑制作用明显。RIEDL S等[6]报道阳离子型抗菌肽能通过与细胞上带阴电荷的成分作用（磷脂酰丝氨酸、唾液酸等）识别肿瘤细胞和非肿瘤细胞，而且肿瘤细胞上的微绒毛也能提高阳离子型抗菌肽的识别能力，抗癌作用主要体现在穿透目标细胞并破坏其细胞膜的完整性，在活体生物试验中，阳离子型抗菌肽对血癌、前列腺癌、卵巢癌等癌细胞具有抗癌活性。LIN M C等[7]通过酶联免疫吸附试验和蛋白印迹试验方法发现从虾中提取的一种抗菌肽（抗脂多糖因子）经抑制p38丝裂原活化蛋白激酶的激活和核转录因子的表达的途径来抑制宫颈癌细胞分泌前炎性细胞活素。抗菌肽作用于肿瘤细胞，却对正常细胞没有毒害作用，这是非常重要的一点。但基于目前此类研究多集中在体外试验，相关基础研究的理论依据还不够充实，因此还需进一步研究。

1.3 抗菌肽的其他功能

抗菌肽不仅具有广谱抗菌活性，且某些抗菌肽还有抗病毒活性，如哺乳动物的防御素和两栖动物皮肤中提取的抗菌素。将美洲大蠊醇提物纯化制成的药物对烧伤、烫伤等外伤有较好的修复作用，目前已有多种临床用途。据BARONI A等[8]的报道，蛙皮素也可能参与伤口的皮肤修复。α-螺旋抗菌肽除了具有抗菌等有益的活性外，也可能具有溶血活性等对机体的其他细胞毒性，POLYANSKY A A等[9]研究表明，α-螺旋抗菌肽的溶血活性与其N末端具有高度疏水性相关，因此可通过在不影响抗菌活性的前提下适当调整N末端结构，减少其溶血活性。

2 抗菌肽的生产

2.1 天然抗菌肽的分离纯化

2.1.1 原料的选择和预处理

提取首先考虑的是样品的选择和预处理的方法。根据大量的研究资料，抗菌肽在很多生物体内广泛存在，且在不同的生物中存在的部位也不一致，如哺乳动物的血液和肠道，两栖动物的皮肤，鱼的皮肤黏液、鳃和肠道，节肢动物的腔体，软体动物的黏液和血淋巴，植物分泌液，微生物的次级代谢产物等能分离得到抗菌物质；对于一些生物，抗菌肽自然存在于生物体内，而在另一些生物中则需要诱导产生，如从昆虫中提取抗菌肽，多数需要刺激，包括机械刺激，菌诱导刺激。

2.1.2 抗菌肽分离纯化

抗菌肽一般的的分离纯化步骤包括：a.溶剂提取或沉淀：包括用离心或超滤除去杂物；b.纯化预处理：如排阻色谱（凝胶渗透色谱法和凝胶层析法）、离子交换层析、固相萃取等，除去盐、阴离子的蛋白质、脂肪物质和其他干扰物质；c.分析型分离：用反相高效液相色谱分离纯化得到具有抗菌活性的肽。

（1）酸提法

乙酸是常用的溶剂，OVCHINNIKOVA T V等[10]用体积分数为10%乙酸匀浆海洋底栖多毛类生物海蚯蚓（Arenicola marina），提取液4 ℃条件下25 000×g离心2 h，离心后上清液经YM-10过滤器超滤，制备性连续酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳（continuous acid urea-polyacrylamide gel electrophoresis，CAU-PAGE）和反相液相色谱（reversed phase liquid chromatography，RPLC）分离出两种亚型分子质量为2 758.3 u的海蚯蚓抗菌肽-1（arenicin-1）和分子质量为2 772.3 u的海蚯蚓抗菌肽-2（arenicin-2），对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌有抗菌活性，其氨基酸序列为RWCVYAYVRVRGVLVRYRRCW和RWCVYAYVRIRGVLVRYRRCW，且含半胱氨酸。CHARLET M等[11]用乙酸从贻贝中提取抗菌肽贻贝属防御素（mytilus defensins），贻贝抗菌肽（mytilins），贻贝抗真菌肽（mytimycin）。

（2）有机溶剂提取法

韩俊友[12]用体积分数80%的甲醇溶液浸提牛蛙的皮肤，12 000 r/min 离心20 min，挥发甲醇，用Sephadex G-50凝胶层析，经反相液相色谱纯化得到2种抑菌活性肽；LI C等[13]用含0.1%三氟乙酸的体积分数60%乙腈浸提绿海胆（Strongylocentrotus droebachiensis），经反相液相色谱纯化提取到了对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抗菌活性的阳离子肽，分子质量4.5 ku的centrocins 1和分子质量4.4 ku的centrocins 2。KONNO K等[14]用含0.1%三氟乙酸的乙腈∶水=1∶1（V/V）的溶液从蛛蜂（Anoplius samariensis）的蜂毒中提取到了抗菌肽。STENSVÅG K等[15]用同样用含0.1%三氟乙酸的体积分数60%乙腈浸提蜘蛛蟹血细胞，经反相液相色谱纯化提取到了由37个氨基酸组成抗菌肽，其N末端结构域富含脯氨酸和精氨酸，C末端结构域含两个双硫键。

（3）硫酸铵沉淀法

LÓPEZ-ABARRATEGUI C 等[16]用 含0.1% HCl 的0.6 mol/L NaCl与海螺（Cenchritis muricatus）（2∶1）匀浆，提取液4 ℃条件下10 000×g离心30 min，上清液4 ℃条件下用饱和度为100%的硫酸铵溶液搅拌1 h，得到沉淀物，10 000×g离心30 min，沉淀用pH 8.0的10 mmol/L Tris-HCl复溶并脱盐，再用Amicon Ultra-15 超滤离心管截留分子质量＞10 ku的物质，溶液经反相液相色谱纯化得到抑菌活性肽。

（4）离心沉淀法

DOLASHKA-ANGELOVA P 等[17]将 海 螺（Rapana venosa）的血淋巴先于4 ℃条件下5 000×g离心30 min，除去细胞内容物，再于4 ℃条件下30 000×g离心4 h，除去血蓝蛋白，上清液分别用截留分子质量3 ku、10 ku和30 ku的微孔滤膜过滤，分子质量在3～10 ku的滤液经反相液相色谱纯化得到抗菌肽。王雪鹏等[18]直接用注射器从贝类体内采集血淋巴，在4 ℃条件下5 000 r/min离心10 min，取上清液，经0.22 μm孔径无菌过滤器过滤，得到的物质对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（E.coli）、白色念珠菌（Candida albicans）有抑制作用。

虽然，从生物体中分离纯化抗菌肽的方法较多，但是，都需要注意的是要保持其抗菌活性，如大部分抗菌肽是阳离子肽，在酸性条件下稳定性较高；且因为它是肽类物质，还应避免发生不可逆性变性。

2.2 抗菌肽的结构分析

2.2.1 一级结构分析

抗菌肽的结构分析包括肽链的末端分析，氨基酸组成和序列分析，二硫键定位和肽段的排序，辅助因子的定位等。分析N端残基或C端残基来确定不同肽链的数量，但N端的氨基和C端的羧基被封闭，或肽链为环肽，分析的难度会增大。N端可采用化学方法（如丹磺酰氯与N端反应生成的丹磺酰基氨基酸进行色谱法检测）和酶法分析。肽链的序列分析之前需要进行氨基酸组成，氨基酸组成分析可使用氨基酸自动分析仪。肽的梯度测序法、质谱法和Edman降解法分析肽链的序列是比较有效的方法。

一级结构的分析有利于将不同生物体或同种生物体的不同抗菌肽进行归类，且有利于研究抗菌肽的抗菌机理。王三山等[19]将12种抗菌肽的氨基酸序列进行分析，不变的氨基酸有Lys6、Gln9、Gly12和Arg16，称为一级保守氨基酸，不同的氨基酸有特定的作用，如碱性氨基酸，与细菌膜的酸性磷脂作用可能相关，Trp2和Lys6处于两亲性螺亲水面的中心部分，对抗菌肽的活性非常重要，C端疏水氨基酸较多可能与穿膜作用相关。

2.2.2 二级结构分析

抗菌肽的二级结构单元大多数由多重氢键稳定，因此稳定性较高，规则的二级结构主要有螺旋（最常见的是α-螺旋）、β-折叠、环形及伸展结构。无论抗菌肽是以α-螺旋、β-折叠还是环形形式出现，两亲结构（具有两个表面，一个亲水、一个疏水）是其共同特征。圆二色谱是快速确定二级结构的方法，α-螺旋构象的特征是一般在222 nm和208 nm处出现负带，在192 nm处出现正带；β-折叠在216 nm出现负带，在接近195 nm有一正带；不规则构象在200 nm以下有一强负带。此外，黄金丰[20]通过圆二色谱分析，发现多肽分子在进入细胞膜的疏水环境中，也将被诱导为螺旋结构，且多肽中心位置的氨基酸替换对多肽的二级结构影响更大。傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）主要用于估计二级结构元素的含量。周杰等[21]利用傅里叶变换红外光谱等方法分析出一种中国林蛙抗菌肽的主要组成是酪氨酸，天冬酰胺（天冬氨酸）和谷氨酸（谷氨酰胺）。二维核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）光谱也是现在较广泛的结构分析技术之一。夏顺霞[22]对S24多肽的二维核磁共振光谱研究表明，其在水中应该是以无规则卷曲的结构存在的。

2.3 抗菌肽的合成

抗菌肽的人工合成，基于对抗菌肽结构的了解。目前抗菌肽的结构分类基本是：线性抗菌肽，包括α-螺旋型，β-折叠型，富含脯氨酸、精氨酸、亮氨酸和甘氨酸或组氨酸样抗菌肽等；含分子内二硫键的环状抗菌肽；多亚基抗菌肽。

基于大部分抗菌肽的特征，合成的抗菌肽一般带阳离子，具有两亲性（螺旋轮法），氨基酸的替换在不改变两亲性的前提下进行，结构简化，可截取天然抗菌肽的部分组合形成杂合肽[24-25]。

李国栋等[26]通过固相合成多肽的方法用一个铰链结构甘氨酸-异亮氨酸-甘氨酸（glycine -isoleucine-glycine，GIG）将抗菌肽cecropin A1的N端1-8序列KWKLFKKI和一段α-螺旋结构序列相连，合成的抗菌肽抗菌活性提高了100倍。CHEN H M等[5]用肽合成仪合成肽CA，CB，CB-1和CB-2，再用树脂，凝胶层析，反相液相色谱分离纯化，纯度达95%。肽CA的抗菌活性低于CB，CB-1和CB-2。CB-1和CB-2对HL-60血癌细胞（HL-60 leukemia）的抑制作用优于CB。SHIN S H等[27]将富含亮氨酸的红海鞘抗菌肽HG1（具有广谱抗菌活性，但在人的血清中抗菌活性不高）替换两个氨基酸残基，新的异构红海鞘抗菌肽（haloganan）在人的血清和伤口的液体中抗菌活性高。

2.4 抗菌肽的基因工程表达

抗菌肽在生物活体中含量少，分离纯化困难且也存在一些安全性问题，人工化学合成抗菌肽的成本高，因此，研究抗菌肽的基因工程表达，有利于降低抗菌肽的生产成本和去除不期望的生理活性，扩大抗菌肽的应用价值[28]。

抗菌肽的基因工程表达一般包括三个重要内容：抗菌肽的基因结构分析，抗菌肽的基因表达调控及互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，Cdna）编码，抗菌肽的基因表达系统。相关研究者通过融合蛋白的方法将抗菌肽的基因在大肠杆菌（E.coli）中表达，巴氏毕赤酵母表达系统相对优于大肠杆菌表达系统，其应用越来越广泛。张果苹等[29]克隆了背角无齿蚌抗菌肽（theromacin）基因的cDNA 全序列，其编码的抗菌肽的氨基酸序列与背角无齿蚌抗菌肽（theromacin）的氨基酸序列相似度达73%，通过实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chainreaction，PCR）分析，发现该基因在外套膜的表达中最高。冷明垒[30]通过构建重组质粒，将苍蝇抗菌肽SK84在大肠杆菌（E.coli）中表达，表达的抗菌肽对苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）有一定的抗菌活性。

3 展望

抗菌肽在生物体中的含量极微，提取成本较高；抗菌肽的化学合成比较困难，基因工程虽是生产抗菌肽的可行方法，但是在微生物中直接表达抗菌肽基因，可能会造成宿主微生物死亡而不能获得表达产物，以融合蛋白的方式表达抗菌肽基因，则有表达效率低的问题等。除生产环节存在困难外，分离纯化也存在产品纯度不高，抗菌肽稳定性较差等问题。在应用方面，抗菌肽的药理、药效、毒理方面的研究，还没形成具体的理论体系，需做进一步的研究。

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