刺葡萄抗白腐病转录因子VdWRKY53基因克隆及表达

冯 虎，张 颖，樊秀彩，姜建福，孙海生，刘崇怀

（中国农业科学院郑州果树研究所，郑州450009）

刺葡萄抗白腐病转录因子VdWRKY53基因克隆及表达

冯 虎，张 颖，樊秀彩，姜建福，孙海生，刘崇怀＊

（中国农业科学院郑州果树研究所，郑州450009）

利用同源克隆的方法，分别获得‘刺葡萄0943’的转录因子VdWRKY53基因的编码区和启动子区域，分析其序列特征，通过实时荧光定量检测其对白腐病菌侵染和水杨酸诱导的反应，并以感病品种欧亚种‘黑比诺’为对照，分析不同种质中转录因子VdWRKY53基因序列及表达差异。结果表明：‘刺葡萄0943’的VdWRKY53基因，在其编码区和启动子区域都有抗病基因的序列和位点特征，在DNA和氨基酸水平上与‘黑比诺’VvWRKY53有5处差异，这5处氨基酸差异可能造成了其功能的差异；‘刺葡萄0943’和‘黑比诺’中的WRKY53基因启动子受葡萄白腐病菌和水杨酸诱导后表达量增加，且VdWRKY53基因表达量和趋势不同于‘黑比诺’VvWRKY53。生物信息学分析和实时荧光定量表明，在‘刺葡萄0943’抗病途径中VdWRKY53转录因子具有重要的生物学作用。

中国野生‘刺葡萄0943’；转录因子；WRKY53；白腐菌；启动子分析

葡萄是中国栽培最广泛的果树之一，葡萄生产上面临的病害主要有炭疽病、灰霉病、白粉病和白腐病等，其中白腐病是由真菌Coniothyrium diplodiella引起的病害，是危害葡萄最严重的病害之一。中国是葡萄的重要起源地之一，是葡萄属植物种类和遗传资源最为丰富的国家［1］，经过对中国野生葡萄系统的研究，发现在这些野生种中蕴含大量的抗性资源，刺葡萄（Vitis davidii Foex）中存在对白腐病抗性极强的株系［2，3］。

植物先天免疫系统由2个免疫反应组成，即病原相关分子模式激发的免疫反应（PAMP－triggered immunity，PTI）和效应蛋白激发的免疫反应（effector triggered immunity，ETI）。PTI途径中包含MAPK（mitogen－activated protein kinases）途径，MAPK途径参与WRKY转录因子激活［4－6］，ETI中WRKY蛋白可以和抗病蛋白（R蛋白）中的NBSLRR（Nucleotide Binding Site－Leucine－Rich Repeat）结合并参与到植物抗逆反应［7］。PTI和ETI都属于系统获得性抗性（systemic acquired resistance，SAR），SAR是水杨酸（SA）介导的植物对病原菌的抗病反应，WRKY转录因子是SA信号传递过程中的重要转录因子。WRKY转录因子广泛的参与到植物防御反应中，其在非生物逆境中起重要作用［8－10］，在生物逆境中WRKY蛋白广泛参与抵御植物病原体的侵袭，例如细菌［11，12］、真菌［13－15］和病毒［16，17］。葡萄全基因组中属于WRKY家族有80个成员［18］。葡萄中已有的关于WRKY基因研究表明WRKY基因在抗逆途径中具有重要作用［19－21］。

WRKY53是WRKY类转录因子重要的成员之一，广泛的参与到植物的抗逆和衰老调控过程，是衰老和病原响应的节点。AtWRKY53参与SA信号途径能够正调控拟南芥的抗细菌斑点病反应［22］。过表达SlWRKY53能增强番茄抵抗盐胁迫的能力［23］。过表达OsWRKY53能引起病程相关蛋白的表达并能增强水稻抗稻瘟病的能力［24］。At－WRKY53参与拟南芥的衰老过程并可以被双氧水诱导，能够负反馈调节自己的表达［25］。拟南芥中AtMEKK1可以与AtWRKY53直接作用也可以结合到AtWRKY53启动子区域调节叶片衰老［6］。分析并验证水稻OsWRKY53启动子发现其中W－box起重要作用，说明其上游受其它WRKY转录因子调控［26］。AtWRKY18能与AtWRKY53互作并在拟南芥衰老调控网络中起作用［27］。

本实验以抗葡萄白腐病的中国野生种‘刺葡萄0943’为主要试材，对照为感病欧亚种黑比诺，从序列特征、启动子差异、病菌和水杨酸诱导后WRKY53基因表达差异和变化，探讨WRKY53基因在‘刺葡萄0943’抗病过程的调控机制。

1 材料和方法

1.1 材 料

本实验材料为中国农业科学院郑州果树研究所国家葡萄种质资源圃保存的‘刺葡萄0943’和‘黑比诺’。针刺法接种白腐菌到‘刺葡萄0943’和‘黑比诺’成龄叶片，保温保湿，创造适合白腐菌发病的条件［5］。SA喷施叶片浓度为1mg／L［28］。在0、6、9、12、24和48h分别取白腐菌和SA处理过的叶片，迅速放到液氮中速冻，存放在－80℃冰箱中准备提取总RNA。

1.2 方 法

1.2.1 DNA、RNA提取和cDNA第一条链合成

DNA提取采用CTAB法，总RNA提取采用Bio Teke植物RNA提取试剂盒提取。用Thermo Scientific Nanodrop 1000微量紫外可见光分光光度计测量浓度并进行琼脂糖电泳确定RNA完整性。采用Fermentas公司的First Strand cDNA Synthesis Kit反转录得到cDNA第一条链。

1.2.2 基因及启动子克隆 采用同源克隆法，根据NCBI中的VvWRKY53序列，使用Vector NTI中的primer find设计引物克隆mRNA序列，上游引物为5′－ATGGAGAACATGGGAAGTTGGG－3′，下游引物为5′－TTAAAAGAATCCCAGGTGGTCGA－3′。根据VvWRKY53序列，采用Blast搜索其上游1 500bp左右序列，使用Vector NTI中primer find设计引物，上游引物为5’－CATTTTGGCTTCCTTAGCATGTG－3’，下游引物为5’－GTTCCCAACTTCCCATGTTCTCC－3’。PCR扩增使用NEB的PhusionTM超保真酶扩增，反应体系为HF缓冲液10μL，2.5mmol／L dNTPs 2.5μL，模板2μL，上下游引物（10mmol／L）各2.5μL，Phusion超保真酶0.5μL，双蒸水补至50μL。PCR反应程序为98℃预变性3min；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸30s，共31个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物经2%琼脂糖胶电泳，使用Omega Gel extract回收试剂盒回收扩增产物，纯化后产物使用TaKaRa的EXTaqTM聚合酶加A。PCR产物平末端加A反应体系为10×buffer 2μL，2.5mmol／L Mg2＋2μL，2.5mmol／L dNTPs 2μL，模板14μL；反应程序：72℃10min。参照pGEMT－easyTM载体构建说明书构建Vd－WRKY49－T载体，转化E.coli DH5α大肠杆菌进行蓝白斑筛选，挑单克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序引物为T7和T7Terminal通用引物。

1.2.3 基因序列和蛋白序列分析 测序结果使用Vector NTI拼接比对，得到CDS序列，并使用DNAman软件分析。VdWRKY53一级结构分析利用瑞士生物信息学研究所（Swiss Institute of Bioinformatics，SIB）提供的ProtParam软件［29］（http：／／web.expasy.org／protparam／）在线分析氨基酸残基数目和组成、蛋白质相对分子质量、分子式、理论等电点及亲水性等理化性质。二级结构分析预测采用phyre2［30］（http：／／www.sbg.bio.ic.ac.uk／phyre 2／html／pagecgi？id＝index）。核定位信号分析预测采用NucPred（http：／／www.sbc.su.se／～maccallr／nucpred／cgi－bin／single.cgi）。

1.2.4 启动子分析 使用PLACE的Plant Cisacting Regulatory DNA Elements［31，32］（http：／／www.dna.affrc.go.jp／PLACE／signalscan.html）预测作用元件，选取起始密码子前‘刺葡萄0943’的1 434bp，黑比诺的1 423bp用来分析。

1.2.5 VdWRKY53实时荧光定量PCR分析 实时荧光定量的仪器为罗氏480，试剂盒选择Biotake的SYBR Real－time PCR Premixture，正向引物5′－GGAAGTTGGGAACAAAAG－3′，反向引物5′－CTTTTGGACCAAGGATTC－3′；内参基因为EF1，内参基因正向引物5′－GAACTGGGTGCTTGATAGGC－3′，反向引物5′－AACCAAAATATCCGGAGTAAAAGA－3′。反应体系为SYBR Realtime PCR Premixture（2×）10μL，上游和下游引物各2μL，cDNA模板2μL，无菌水4μL。每个样品设置3次重复。反应条件为95℃预变性5min；95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸20s，共45个循环。数据分析方法采用相对定量的方法，采用2－△△CT方法分析相对基因表达差异。

2 结果与分析

2.1 基因序列和蛋白序列分析

VdWRKY53与VvWRKY53核酸序列比对分析显示（图1），可以看出有9处差异（细线框圈的为差异点）。VdWRKY53与VvWRKY53蛋白序列比对分析结果（图1）可以看出，氨基酸序列存在5处差异。在氨基酸序列中‘刺葡萄0943’中68位为组氨酸（H），‘黑比诺’为谷氨酰胺（Q）；‘刺葡萄0943’73位为丝氨酸（S），‘黑比诺’为甘氨酸（G）；‘刺葡萄0943’78位为缬氨酸（V），‘黑比诺’为异亮氨酸（I）；‘刺葡萄0943’198位为H，‘黑比诺’为Q；‘刺葡萄0943’300位为G，‘黑比诺’为精氨酸（R）。73位的S和G都是极性不带电氨基酸，78位都是非极性氨基酸，这2个位点不同对氨基酸的功能影响不大。‘刺葡萄0943’中68和198位的H为极性带正电荷氨基酸，300位G为极性不带电荷氨基酸；‘黑比诺’68位的G和198位的Q为极性不带电荷氨基酸，300位的R为极性带正电荷氨基酸。Vd－WRKY53和VvWRKY53保守域和DNA结合域完全一致，氨基酸序列的差异位点不在WRKY蛋白的保守域，但是氨基酸极性的改变和所带电荷的改变可能会改变蛋白结构。73位的S和G都是极性不带电氨基酸，78位都是非极性氨基酸，这2个位点不同对氨基酸的功能影响不大。‘刺葡萄0943’中68和198位的H为极性带正电荷氨基酸，300位G为极性不带电荷氨基酸；‘黑比诺’68位的G和198位的Q为极性不带电荷氨基酸，300位的R为极性带正电荷氨基酸。VdWRKY53和VvWRKY53保守域和DNA结合域完全一致，氨基酸序列的差异位点不在WRKY蛋白的保守域，但是氨基酸极性的改变和所带电荷的改变可能会改变蛋白结构。

VdWRKY53蛋白氨基酸组成成分如图2所示。通过ProtParam工具分析该蛋白分子量为39 978.2Da，分子式为C1734H2678N496O562S16，原子总数为5 486个，理论等电点为5.51，消光系数27 180（280nm），不稳定系数56.61，即该蛋白不稳定，总平均亲水性为－0.693，为亲水性蛋白。氨基酸组分中，Ser和Gly含量最高，Trp和Cys含量最低；酸性氨基酸残基总数（Asp＋Glu）为40个，碱性氨基酸（Arg＋Lys）为31个。

图3为葡萄与其他植物WRKY53蛋白序列比对结果，从图中可以看出这些WRKY53的保守域具有较高的同源性。不同植物WRKY53共有序列在VdWRKY53二级结构预测中为α螺旋和β折叠。说明WRKY53中含有非常保守的序列，结构决定功能，这些保守域说明不同植物中WRKY53转录因子具有相似功能。从图4系统发育树中可以看出亲源关系的远近，葡萄聚类到一起，相比拟南芥，麻风树与葡萄的亲源关系更近。

2.2 启动子分析

将启动子序列分别提交到PLACE网站进行分析，得到分析结果与抗逆相关的顺式作用元件统计如表1。从统计结果可以看出，与逆境及转录增强相关的顺式作用元件共有26个，如与ABA、GA、SA和JA等激素调控相关的作用元件，而已有的研究表明这些激素都参与到植物的抗逆反应之中。2种葡萄中WRKY53启动子区域顺式作用元件基本一致，但是在‘刺葡萄0943’中特有MYBST1和PRECONSCRHSP70A等2个顺式作用元件，而‘黑比诺’中特有PYRIMIDINEBOXHVEPB1顺式作用元件。MYBST1为病原菌诱发响应元件。‘刺葡萄0943’中的CAATBOX1增强子则比‘黑比诺’中少1个，但是CTRMCAMV35S增强子则比‘黑比诺’中多6个。如图5中二者的启动子序列比对有2处明显差异，一处是VvWRKY53缺失，缺失部分对应的VdWRKY53部分多了2个CTRMCAMV35S；另一处是二者序列差异较大，Vd－WRKY53中不含顺式作用元件，而VvWRKY53中含有PYRIMIDINEBOXHVEPB1、GT1GMSCAM4和两个GT1CONSENSUS。这些预测的顺式作用元件位点表明葡萄中的WRKY53转录因子极有可能参与到植物抗逆抗病反应。两者之间的顺式作用元件存在差异，从二者的统计情况可以看出WRKY53启动子中的顺式作用元件表现出与抗逆相关，这表明WRKY53转录因子可能参与到葡萄的抗逆途径中。

2.3 实时荧光定量分析

从图6中可以看出‘刺葡萄0943’在接种白腐菌6h后，VdWRKY53表达量达到最高值，其在喷施SA之后6h表达下调随后表达量上升，24h达到最高值。‘黑比诺’在接种白腐菌后WRKY53表达量先下降后上升，喷施SA之后6h表达量达到最高值随后下降。‘黑比诺’和‘刺葡萄0943’在接种白腐菌和SA之后WRKY53表达趋势不一致。WRKY53在这2种葡萄中接种白腐菌之后表达量都增加，说明WRKY53对白腐菌侵染有响应，但是2种葡萄中响应时间及趋势不同。

3 讨 论

VdWRKY53和VvWRKY53二者有5个氨基酸的差异，这种差异对WRKY53在这2种葡萄中的功能到底有什么影响？‘刺葡萄0943’中68和198位的H为极性带正电荷氨基酸，300位G为极性不带电荷氨基酸；‘黑比诺’中68位的G和198位的Q为极性不带电荷氨基酸，300位的R为极性带正电荷氨基酸。VdWRKY53和VvWRKY53保守域和DNA结合域完全一致，氨基酸序列的差异位点不在WRKY蛋白的保守域，但是氨基酸极性的改变和所带电荷的改变可能会改变蛋白结构。从二维结构分析中可以看出VdWRKY53含有3个α螺旋，5个β转角。VdWRKY53经过比对分析，含有典型的WRKY域，2个半胱氨酸和两个组氨酸，VdWRKY53属于典型的WRKY基因第II家族成员。VdWRKY53预测的核定位信号RKRK得分为0.89，定位到细胞核中。通过对比不同植物中的WRKY53并结合VdWRKY53的二级结构预测可以看出WRKY53具有相同的保守区域，Vd－WRKY53的功能和其它植物中的WRKY53相似。

通过分析VdWRKY53和VvWRKY53启动子区域的与抗逆相关的作用元件，存在差异。顺式作用元件，表明WRKY53基因可能参与到植物的抗逆反应。转录增强子CTRMCAMV35S数量存在差异，‘刺葡萄0943’中比‘黑比诺’中的多6个，此外‘刺葡萄0943’启动子序列中特异含有与抗逆相关的MYBST1和PRECONSCRHSP70A两个作用元件，其中MYBST1是病原菌诱发响应元件，PRECONSCRHSP70A与热休克蛋白相关。‘黑比诺’中特异含有PYRIMIDINEBOXHVEPB1，其与GA和ABA诱导相关。这两种葡萄中都含有与JA相关的T／GBOXATPIN2顺式作用元件，拟南芥中已有报道表明AtWRKY53受JA的负调控［33，34］。拟南芥中AtWRKY53能负反馈调节自身表达［25］，2种葡萄WRKY53启动子序列中都含有W－box顺式作用元件WBBOXPCWRKY1、WBOXATNPR1和WBOXNTERF3，葡萄中的WRKY53可能受到自身或其他WRKY转录因子的调控。拟南芥中的研究发现AtWRKY53依赖SA途径中的NPR1调控［35，36］，ASF1MOTIFCAMV和GT1CONSENSUS顺式作用元件与SA相关，SA介导SAR反应，葡萄中WRKY53可能参与SAR途径。ABRELATERD 1、EBOXBNNAPA、MYB1AT、MYB2CONSENSUSAT、MYBCORE、MYCATRD22、PYRIMIDINEBOXHVEPB1等顺式作用元件和ABA调控相关，

PTI和ETI都属于SAR，SA介导SAR途径参与植物防御反应。‘刺葡萄0943’和‘黑比诺’叶片喷施SA和接种白腐菌之后，WRKY53在这2个葡萄中的表达趋势不一致，二者的启动子序列比对有2处明显差异，一处是VvWRKY53缺失，缺失部分对应的VdWRKY53部分多了2个CTRMCAMV35S，VdWRKY53接种白腐菌之后表达量比VvWRKY53多可能与CTRMCAMV35S相关；另一处是二者序列差异较大，VdWRKY53中不含顺式作用元件，而VvWRKY53中含有2个GT1CONSENSUS，GT1CONSENSUS与SAR相关，SAR通过SA介导，这可能是VvWRKY53喷施SA之后表达量比Vd－WRKY53高的原因。

WRKY基因家族庞大，多数对逆境响应，少数WRKY转录因子启动子区域可以被自身或其他WRKY转录因子调节。水稻中OsWRKY13可以结合到OsWRKY13启动子的顺式作用元件上［37］。WRKY53的调控特点，已有的关于WRKY53的研究表明，拟南芥AtWRKY53在核中能与MAP激酶MPK4结合［38］，AtMEKK1也可以与AtWRKY53直接作用，也可以结合到AtWRKY53启动子区域调节叶片衰老［6］。AtWRKY53在拟南芥的衰老过程能被双氧水诱导，可以够负反馈调节自己的表达［25］。AtWRKY46、AtWRKY53和AtWRKY70相互作用参与拟南芥抗病途径［22］。AtWRKY18能与AtWRKY53互作并在拟南芥衰老调控网络中起作用［27］。水稻中OsWRKY53受其他WRKY转录因子调控［26］。在小麦和玉米中WRKY53上游调控基因有GST，在氧胁迫逆境中WRKY53调控下游ORK10和POC1的表达［39］。拟南芥中E3泛素连接酶UPL5能抑制WRKY53的表达进而调节衰老过程［40］。在研究拟南芥抗丁香假单胞菌研究中发现AtWRKY53是SA途径的下游基因，被JA和乙烯负调控［35］。拟南芥中AD蛋白能正调节WRKY53的表达，同时AD蛋白可以被过氧化氢诱导被JA抑制［41］。VdWRKY53启动子中存在与上述功能相关的多种顺式作用元件，如与SAR、JA、ABA、水胁迫等相关的顺式作用元件。这些顺式作用元件可能在VdWRKY53的调控网络中起重要作用。

通过同源克隆得到‘刺葡萄0943’的Vd－WRKY53CDS序列和启动序列，经过生物信息学分析基因的一级结构、二级结构以及启动子中的顺式作用元件，并与‘黑比诺’中的VvWRKY53作对比得出其在抗逆途径具有重要功能，结合拟南芥和其他物种中对WRKY53的研究可以推导出葡萄中WRKY53在抗逆调控中具有重要功能，实时荧光定量验证得出，VdWRKY53参与葡萄中SA介导的抗白腐病途径。终上所述得出：VdWRKY53在葡萄抗白腐病途径中具有重要的生物学作用。

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（编辑：宋亚珍）

Cloning and Expression of Transcription Factor VdWRKY53in Vitis davidii

FENG Hu，ZHANG Ying，FAN Xiucai，JIANG Jianfu，SUN Haisheng，LIU Chonghuai＊
（Zhengzhou Fruit Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450009，China）

In order to clone VdWRKY53transcription factor from‘Vitis davidii 0943’，reveal the relationships between its sequence signature，gene function and the resistance to white rot fungi and reveal the molecular regulatory mechanisms of resistant germplasm preliminary，we designed primers and cloned Vd－WRY53of‘Vitis davidii 0943’based on the known homologous sequences VvWRKY53.Its expression was verified through bioinformatic analysis of genes，promoters and real－time fluorescence quantitative PCR after inoculating white rot fungi and spraying salicylic acid.The expression of WRKY53can be monitored in both‘Vitis davidii 0943’and‘Pinot Noir’grape which inoculate white rot fungi or salicylic acid by real－time fluorescence quantitative PCR verification.The CDS and promoter of the Chinese wild grape‘Vitis davidii 0943’VdWRKY53both have the resistance genes feature.At the same time VdWRKY53is different from the‘Pinot Noir’grape and the nucleic and animo acids are also different.These differences may cause different functions.VdWRKY53plays an important biological function in grape disease resistance by bioinformatic analysis and real－time fluorescence quantitative PCR.

Chinese wild grape Vitis davidii 0943；transcription factor；VdWRKY53；white rot fungi；promoter analysis

Q786；Q789

A

1000－4025（2015）08－1497－09

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.08.1497

2015－04－23；修改稿收到日期：2015－07－21

国家自然科学基金（31201599），国家葡萄产业技术体系（CARS－30），中国农业科学院科技创新工程专项经费（CAAS－ASTIP－2015－ZFRI）

冯 虎（1990－），男，在读硕士研究生，主要从事葡萄抗白腐病方向研究。E－mail：fenghu01＠126.com

＊通信作者：刘崇怀，博士，研究员，主要从事葡萄资源育种方向研究。E－mail：liuchonghuai＠caas.net.cn