Ion Torrent测序检测非小细胞肺癌外周血DNA的临床价值*

洪英财， 陈怀生， 刘 均， 林少霖， 王 正， 杨 林， 王光锁

(暨南大学第二临床医学院/深圳市人民医院胸外科， 广东 深圳 518000)

近年来，肺癌已经成为最常见的癌症之一，同时其也是我国发病率及致死率最高的癌症，根据2008我国肺癌统计数据表明，仅有15.8%的肺癌患者在确诊后生存期能超过5年［1］。在所有肺癌病例中，非小细胞肺癌就已经占到了4/5，是最为常见的肺癌类型。在治疗非小细胞肺癌的药物当中，近年来，分子靶向药物因其特异，高效，副作用小的特点而得到了广泛推广和临床应用。靶向治疗是基于肿瘤细胞与正常细胞分子存在差异化，而开发的专一性药物，因此它仅能对肿瘤的特有结构或与肿瘤细胞信号传递有关的受体、酶和蛋白等因子有效，从根本上杀死肿瘤细胞或抑制其生长。所以给予靶向治疗前，一定要确认特定靶点基因的状态，从而评估每位患者对特定药物的敏感性和毒副反应的大小，以确保在安全的前提下进行用药［2］。

Ion Torrent测序是第三代测序技术，其不但使DNA聚合酶自身反应速度得到实现，能够在1s即可测10个碱基，相对于化学法测序其效率显著提高甚至超过2万倍，同时实现了DNA聚合酶内反应的自身延续，对于蛋白质片段的合成具有积极意义，显著提高了基因组的重复序列的拼接的效率［3］。其能够直接测RNA的序列，降低体外逆转录产生的系统误差［4］。并对甲基化的DNA序列进行直接的测定，更好的提高了基因测序效率。从而实现了基因层面对患者的外周血DNA进行检测，对非小细胞肺癌患者进行基因诊断和治疗的可行性［5］。本研究主要通过Ion Torrent测序对手术前后患者外周血DNA进行检测，以更好的为临床肿瘤靶向治疗提供依据，现报告如下:

1 资料与方法

1.1 一般资料:选择2012年8月至2014年2月医院收治的非小细胞肺癌患者80例，所有患者均经临床表现、影像学检查以及病理组织活检确诊，按照数字随机法分为两组，各40例，其中观察组:男31例，女9例，年龄43－69岁，平均(54.3±2.9)岁，肺癌确诊病程1－5年，平均(2.1±0.3)年;对照组:男32 例，女8 例，年龄42－69岁，平均(54.2±2.8)岁，肺癌确诊病程1－5 年，平均(2.0±0.3)年。

1.2 入选及排除标准:入组标准:①经病理组织学/细胞学检查诊断为非小细胞肺癌;②年龄18岁－75周岁;③ECOG评分0－2分;④预计生存期≥2个月;⑤主要器官功能正常;⑥自愿入组，签署知情同意书，依从性好，配合随访;⑦距离大手术4周以上。排除标准:①合并未能控制的中枢神经系统转移，具有颅高压表现;②具有出血倾向，特别是1月内出现过明显的消化道出血;或正在接受溶栓或抗凝治疗;③30d内使用过其他研究药物，或同时参加其他临床研究;④6个月内出现过心肌梗塞，或目前存在不稳定性心绞痛、心功能不全;⑤合并严重慢性阻塞性肺病和/或呼吸衰竭;⑥双侧胸腔大量积液或包裹性胸腔积液;⑦患者依从性差，或患有精神疾病;⑧已知对本试验用药及其辅料过敏;⑨目前存在未控制的严重感染。⑩妊娠期或哺乳期女性患者，不愿采取避孕措施的育龄患者(包括男性)。

1.3 Ion Torrent测序的工作原理:以基因组学技术为基础，结合无创检测技术，通过采用新一代快速测序平台－第三代测序技术 Ion Torrent，来对非小细胞肺癌病人外周血循环DNA进行检测，探索其在个体化用药指导上的价值。先将含测序的DNA样本置入微孔，然后使用数量巨大的且未经处理的核苷酸(DNTP)，依次穿过微孔;根据碱基互补配对原则DNA聚合酶会将相应核苷酸置入延伸链，通过延伸反映获得的氢离子直接改变反映体系的PH值，测序仪就可以这种变化为基础进行测序。

1.4 研究方法及观察指标:采集非小细胞肺癌病人外周血循环DNA，观察组利用三代测序技术Ion Torrent检测，对照组使用第1代测序技术Sanger末端终止法进行测序，比较手术前后通过Ion Torrent测序所得EGFR和K－ras结果，并统计两组测序EGFR阳性1年生存情况。

1.5 统计学处理:应用SPSS13.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，两组间均数的比较使用t检验，组间率的比较采用χ2检验，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 未手术者Ion Torrent测序EGFR和K－ras结果比较:未手术者观察组EGFR阳性和K－ras突变阳性检出率均显著高于对照组(P＜0.05)，见表1。

表1 未手术者Ion Torrent测序EGFR和K-ras结果比较 n(%)

2.2 术后复发患者Ion Torrent测序EGFR和K－ras结果比较:术后复发患者观察组EGFR阳性和K－ras突变阳性检出率均显著高于对照组(P＜0.05)，见表2。

2.3 两组测序EGFR阳性1年生存情况比较:观察组1年死亡8例，生存率为80.0%，对照组1年死亡19例，生存率为52.5%，观察组生存率显著高于对照组(χ2=6.765，P=0.009)。

3 讨论

在非小细胞肿瘤个体化用药指导治疗中，人们发现，因多种因素导致取样存在各种阻力和无法实现不间断检测等的影响，导致无法充分达到针对性对非小细胞肺癌患者指导用药的目的，加之检测持续时间过长和高额的监测费用，导致其在实际的临床应用中遇到了重重困难［6］。只有克服以上困难，建立起一个既高效迅速又经济实惠的新的诊断手段，才能达到个性化指导非小细胞肺癌患者用药的目的，其临床价值也是非常巨大的［7］。第三代测序技术 Ion Torrent，不但能够通过单个平台全面研究肿瘤基因组、转录组和表观遗传的改变以及单从基因组维度上亦可同时检测点突变、拷贝数变异和结构变异等所有DNA变异类型的能力，而且它加快了测序速度，同时优化了数据分析过程［8］。即使是面对需要从头到尾进行测试数百碱基片段，也能达到99.9%以上的测序准确度［9］。其摒弃了第一二代测序技术中采用生物发光检测延伸产生的焦磷酸的检测原理，通过检测DNA链延伸时产生的氢离子实现边合成边测序，通过微乳液PCR制备测序模板，然后将制备得到的微球模板罝于一种半导体芯片上，加入含有DNA聚合酶的测序反应液，并循环加入4种脱氧核糖核苷酸(dNTP)，通过高灵敏的pH敏感电极测定与模板互补的dNTP被掺入时释放的H2，从而实现对模板序列的测定［10］。

本研究所研究的非小细胞肺癌药物靶向基因为EGFR和K－ras。EGFR是一种跨膜受体，在大部分的NSCLC患者身上都能够检测到EGFR。其中最为最常见的EGFR突变为外显子E19del和外显21L858R突变，能够在接近50%的患者身上监测到，其诱发的酪氨酸激酶活化，是靶向治疗药物厄洛替尼、吉非替尼治疗活性的指标之一［11］。K－ras是一种 GTP结合蛋白，研究发现K－ras基因突变现出现在消化系统恶性肿瘤患者的血液中，这一检测的应用有助于肿瘤及早被诊断出来，并为预后判断和复发监测提供重要参考依据。目前肿瘤特征性靶基因已经在循环血中被检测出来，从而使以前肿瘤基因检测只能从肿瘤组织着手的问题得到改变。研究称20%的非小细胞肺癌存在K－ras突变，而肺腺癌更是占到了40%左右。K－ras突变状态还能够作为生存的预后指标。研究提示［12］出现K－ras基因突变的非小细胞肺癌患者其生存时间显著短于K－ras野生型者。同时基因组测序技术发展也及其迅速，以Ion Torrent、Illumina Mi－ seq和Pac－Bio为代表的基于单分子测序的第三代测序仪能够全面高效研究肿瘤基因组、转录组和表观遗传的改变，还能够检测出点突变、拷贝数变异和结构变异等所有DNA变异类型的能力，较以往的测序仪，相同时间内测量通量已经提高了100倍，表现出高效，经济，简便等特性，具有临床推广应用的巨大潜力。本研究观察组采用Ion Torrent测序法测定术前术后复发患者EGFR和K－ras情况，发现使用Ion Torrent测序法测定术前及术后复发患者EGFR阳性和K－ras突变阳性的检出率均显著高于使用第一、二代测序法者。Ion Torrent测序技术借助了半导体芯片技术，和激光测序不同的是，它是建立在化学和数字信息基础之上的一种新型技术。通过大规模并行半导体感应器，实现对DNA离子流的实时监测。由于Ion Torrent半导体芯片上的反应孔能够高速有效的将遗传信息翻译成数码的DNA测序结果，从而得到大量精确的测序数据。故通过本组研究我们认为:对非小细胞肺癌患者使用Ion Torrent测序技术测定外周血DNA，能更准确的确定患者基因类型，从而为分子靶向治疗提供依据。

表2 术后复发患者Ion Torrent测序EGFR和K-ras结果比较 n(%)

图1 两组测序EGFR阳性1年生存情况比较

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