三七皂甙Rb1对大鼠慢性阻塞性肺疾病线粒体的防护作用

刘鹏年 李忆兰 张路 谢飞 李剑瑜 武凡

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)以持续气流受限为特征，是导致高致残率和高致死率的呼吸系统的慢性疾病之一，目前尚无有效的治疗方法。三七总皂甙是五加科人参属植物三七的主要有效的活性成分，其中以三七皂甙Rg1、Rb1及三七皂甙R1含量最高，目前对三七皂甙Rg1研究较多，但对Rb1知道甚少，而且机制尚不明确［1］。对三七皂甙Rb1的研究主要是探讨三七皂甙对自由基和细胞因子的影响，对其防护COPD线粒体的作用机理目前鲜见报导［2］。课题组用烟熏法复制大鼠COPD模型，从组织学、生物化学、生物物理学等方面多层次地研究三七皂甙单体Rb1对慢性阻塞性肺疾病大鼠线粒体的作用及作用机理，为开发三七单体Rb1在临床防护COPD的应用提供尽可能详尽的试验依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

三七皂甙Rb1购自昆明植物研究所;呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及ATP合酶试剂盒购自R＆D system公司;亲脂性阳离子荧光染料Rhodamine123购于 sigma 公司;1，6-二苯基-1，3，5 乙三稀(1，6-diphenyl-1，3，5-hexatriene，DPH)购自瑞典 Fluka 公司;分泌型磷脂酶A2(secretory phospholipase A2，sPLA2)试剂盒购自assay kit，R＆D system公司，采用全自动酶免分析仪测定，sPLA2活性的测定严格按照说明书进行。

1.2 实验动物

雄性Wistar大鼠40只，体质量(200±10)g，动物购自河北医科大学动物试验中心，合格证号:冀医动字号04056。

1.3 动物模型复制

参照文献［3］并加以改进，将40只大鼠随机分为4组，每组10只，Ⅰ组PBS灌胃作为对照组，Ⅱ组COPD模型制作:第1天和第14天向气管内滴入LPS各 1 g/L，2～13日和 15～42日在 80 cm×50 cm×40 cm密闭箱内香烟熏蒸0.5小时(烤烟型，焦油量14 mg，烟气烟碱量1.1 mg)，Ⅲ保护组在制模同时每日腹腔注射Rb1 10 mg/kg为Rb1组低剂量，Ⅳ保护组每日腹腔注射Rb1 20 mg/kg为Rb1组高剂量组，COPD模型组每日腹腔注射等剂量生理盐水。制模后处死各组大鼠，提取肺脏线粒体作呼吸链复合体活性、ATP合酶活性、线粒体膜电位、线粒体荧光偏振度及sPLA2活性测定。

1.4 标本采集

1.4.1 线粒体的提取 制模后处死大鼠，迅速取出新鲜大鼠肺脏，加入带有冰渣的分离介质中，电动匀浆器匀浆，制成10%的肺组织匀浆液，用低温差速600 g离心10分钟，取上清，再以12500 g离心10分钟，留沉淀，此为肺脏组织线粒体。沉淀用分离介质再次悬浮，以12500 g离心10分钟，本次沉淀为提纯的线粒体，沉淀加入分离介质制成线粒体悬液，用以下面各指标测定。

1.4.2 呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及ATP合酶的测定 用于测定呼吸链复合酶的线粒体悬液稀释成2 mg/mL，分装后－70℃保存，测定前反复冻融3次使之成为线粒体膜片段，呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及ATP合酶的测定，严格按照说明书用分光光度法测定，呼吸链的活性单位nmol/(min·mg)蛋白质。ATP合酶的活性单位为μmolPi/(min·mg)。

1.4.3 线粒体膜电位和线粒体膜流动性的测定

参照文献［4］提取线粒体，以阳离子荧光染料Rhodamine123所引起的递质中荧光值的变化反映线粒体膜电位。用荧光分光光度计测量，激发波长500 nm，发射波长525 nm，荧光基准值为F1，再加入100 μL线粒体，5000 g离心10分钟，取上清测定荧光值F2，以ΔF=(F1－F2)，线粒体蛋白量(mg)－1计算每mg线粒体蛋白引起的荧光变化。线粒体摄取Rhodamine123增加，则膜电位水平增加。Rhodamine123在活细胞内主要与线粒体结合，线粒体受损时，摄取Rhodamine123的量偏低，膜电位下降。

线粒体膜流动性的测定:取肺脏组织，参照文献［4］提取线粒体内膜，采用荧光标记与荧光偏振法，激发光波362 nm，发射光波长432 nm，在荧光分光光度计上(加偏振片)测定膜荧光偏振度(P)，按公式η=2p/0.46－P，求出平均微黏度。荧光偏振度越高，微黏度就越高，膜的流动性越低。

1.4.4 sPLA2活性的测定 采用全自动酶免分析仪测定，sPLA2活性的测定严格按照说明书进行。

表1 Rb1对COPD大鼠肺脏线粒体呼吸链复合物(Ⅰ～Ⅴ)活性的影响

1.5 统计学处理

各组数据用SPSS 16.0统计软件分析进行数据处理，计量资料用(±s)表示，并经正态性检验及方差齐性检验。多组间均数比较采用单因素方差分析，方差齐时两两比较采用组间Q检验，检测各资料的统计学显著性差异，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异非常显著。

2 结果

2.1 Rb1对COPD大鼠肺脏线粒体呼吸链复合物(Ⅰ～Ⅴ)活性的影响

呼吸链(Ⅰ～Ⅳ)的活性单位nmol/(min·mg)蛋白质。呼吸链Ⅴ即ATP合酶的活性单位为μmol Pi/mg。呼吸链复合体Ⅰ～Ⅳ称为线粒体电子传递体。

本试验观察到与对照组相比，COPD组大鼠肺脏线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ活性显著下降(P＜0.01)，分别下降51.0%、55.3%和60.8%、57.3%。由表1可见，Rb1 10 mg/kg治疗组和Rb1 20 mg/kg治疗组与COPD组相比有显著性差异(P＜0.01)。而对于复合物Ⅳ的活性，Rb1 10 mg/kg治疗组与Rb1 20 mg/kg治疗组相比，差异有显著性(P＜0.05)。提示:COPD严重影响大鼠肺脏线粒体呼吸链复合物的活性，尤其是复合物Ⅳ即限速酶的活性;Rb1对大鼠肺脏线粒体膜的呼吸链复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的活性有显著保护作用。

2.2 Rb1对COPD大鼠肺脏线粒体膜电位和膜流动性的影响

实验结果显示:与对照组相比，COPD组大鼠摄取Rhodamine 123显著降低，相对荧光强度低，线粒体膜电位显著低于对照组(P＜0.01)，说明线粒体膜的结构受损。COPD组线粒体膜的偏振度增加，膜的微黏度升高，导致线粒体膜的流动性下降。Rb1 10mg/kg组和Rb1 20mg/kg组与COPD组相比有明显差异(P＜0.01)，提示Rb1对慢阻肺线粒体膜的保护作用。见表2。

表2 Rb1对COPD大鼠肺脏线粒体膜电位和膜流动性的影响

2.3 三七皂甙Rb1对COPD大鼠肺脏线粒体sPLA2活性的影响

与对照组相比，COPD组大鼠肺脏线粒体sPLA2于制模后迅速增高，P＜0.01;与COPD组相比，Rb1 10mg/kg组和Rb1 20mg/kg组sPLA2活性明显低于相应的COPD组，P＜0.01;与Rb1 10mg/kg组相比，Rb1 20mg/kg组sPLA2活性有显著性差异，说明Rb1减低sPLA2活性的剂量依赖性。见表3。

表3 三七皂甙Rb1对COPD大鼠肺脏线粒体sPLA2活性的影响

3 讨论

De-Luca等［4］认为COPD患者肺实质破坏的典型表现为小叶中央型的肺气肿，由炎症介质引起的肺脏线粒体结构与功能的改变及细胞因子网络的紊乱被认为是肺脏线粒体结构破坏的主要机制。目前对COPD主要采用对症治疗，现有的治疗方法令人堪忧。本实验详细的研究COPD大鼠肺脏线粒体膜复合物的结构与功能的改变、细胞因子sPLA2的变化，探讨三七皂甙Rb1对COPD大鼠肺脏线粒体的防护作用及作用机理。

线粒体呼吸链的电子传递是由5个酶复合体构成的，呼吸链复合体Ⅰ～Ⅳ称为线粒体电子传递体，进行电子传递和将质子跨膜到线粒体内膜外的功能。呼吸链复合体Ⅳ是线粒体电子传递链的末端转移酶，是氧化磷酸化的限速酶［5］。当质子顺此梯度经复合体Ⅴ(ATP合酶)F0部分回流时，其F1部分催化ADP和Pi生成ATP，因此ATP合酶能直接反应线粒体的呼吸功能［6］。本实验支持 Makabe［5］的观点，观察到COPD大鼠线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ活性显著下降，表明COPD不仅对以NADH为底物的呼吸链起始端有影响，且对呼吸链的限速酶复合物Ⅳ影响尤为显著(P＜0.01)。由于线粒体电子传递体功能下降，不能建立起有效的质子跨膜梯度，因此ATP生成减少;同时本实验观察到能直接反应线粒体呼吸功能的ATP合酶活性下降，进一步ATP生成减少，加重线粒体的损害。三七皂甙Rb1组与COPD组相比，三七皂甙Rb1明显增高呼吸链复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ复合物的活性、总ATPase活性，P＜0.01。本实验表明三七皂甙Rb1对COPD大鼠线粒体呼吸链复合体有显著的保护作用，有利于线粒体结构与功能的恢复。

Makabe［5］报道线粒体呼吸链复合物的损伤可促进线粒体膜通透性增高，离子转运功能紊乱，影响线粒体膜电位的正常维持。本实验观察到COPD大鼠肺脏线粒体膜电位显著下降，与对照组相比P＜0.01，三七皂甙Rb1明显增高线粒体膜电位，提高线粒体的功能。

正常的线粒体膜流动性为膜发挥各种生理功能，呼吸链上电子传递过程和氧化磷酸化过程均依赖与呼吸链活性成分在内膜中的侧向扩散和碰撞，即膜的流动性［7］。本实验采用荧光偏振法。实验检测到COPD大鼠线粒体膜流动性明显下降，其差异均有统计学意义，P＜0.01，提示大鼠线粒体呼吸链复合物的损伤，导致线粒体膜刚性增加，流动性下降，与李忆兰等［8］研究的急性COPD大鼠线粒体膜偏振度相比，没有明显差异，说明急性和慢性COPD大鼠线粒体膜的流动性均下降明显。与COPD组大鼠线粒体相比，三七皂甙Rb1 10 mg/kg组和Rb1 20 mg/kg组减低荧光偏振度，降低微黏度，导致膜流动性显著增加，P＜0.01，保护了线粒体膜，使其发挥正常的功能。

DeLuca等［9］提出sPLA2参与肺组织炎症的产生和肺泡表面活性物质的代谢，在急慢性肺损伤中起着重要作用，有可能成为肺损伤治疗的靶点。目前有学者报道［10］在正常情况下，磷脂酰丝氨酸位于磷脂双分子层的内侧不易被sPLA2水解。当肺脏线粒体受损时，线粒体膜分子重排，磷脂酰丝氨酸暴露在胞膜外侧，而sPLA2水解的最适底物为磷脂酰丝氨酸，因此sPLA2迅速水解磷脂酰丝氨酸产生并释放脂类介质，加重了COPD线粒体的损害，而线粒体损害使sPLA2活性进一步增高，sPLA2在这个级联反应中处于关键位置。三七皂甙Rb1明显降低sPLA2活性并对其有明显剂量依赖性，因而降低COPD线粒体损伤的产生与扩散。

总之COPD的形成是一个综合的多因素参与的过程，sPLA2对线粒体膜磷脂酰丝氨酸的水解造成线粒体膜的结构与功能的改变。三七皂甙Rb1通过降低sPLA2活性和脂类介质对COPD线粒体的损害，维持了肺脏线粒体正常膜电位，恢复膜的流动性，使呼吸链复合物活性恢复，改善了线粒体能量代谢，对COPD大鼠肺脏线粒体有显著的保护作用，从而起到防治COPD的作用。

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