利用豆腐黄水发酵生产酵母单细胞蛋白的研究

刘桂萍， 赵琪锐， 杨贺龙

(沈阳化工大学 制药与生物工程学院， 辽宁 沈阳 110142)

利用豆腐黄水发酵生产酵母单细胞蛋白的研究

刘桂萍， 赵琪锐， 杨贺龙

(沈阳化工大学 制药与生物工程学院， 辽宁 沈阳 110142)

以豆腐黄水为液体培养基，酵母红-2为发酵菌种，研究不同培养条件对发酵生产酵母单细胞蛋白的影响，通过正交实验确定最佳发酵条件.实验结果表明：当豆腐黄水体积分数为70 %、培养温度为30 ℃、接种量7 %、装液量为50 mL/250 mL三角烧瓶、150 r/min摇床发酵培养37 h后,酵母单细胞蛋白产量可达4.15 g/L，其蛋白质量分数达27 %以上.

豆腐黄水； 酵母菌； 发酵； 单细胞蛋白

大豆是世界上产量最多的油料作物，是人类植物蛋白和食用油的主要来源之一.我国大豆食品工业发展迅速，产生的食品废水也随之增多.大豆蛋白废水含有大量的糖、蛋白质和脂肪类有机物，且不含有毒有害物质，是培养酵母菌生产单细胞蛋白的理想原料[1].利用豆腐废水生产单细胞蛋白，不仅可以有效地利用废水中的营养成分，减少环境污染，而且能带来较高的经济效益，延长产业链，促进循环经济的发展.

我国已有生产单细胞蛋白的研究，徐坚平等利用秸秆进行微生物发酵生产单细胞蛋白[2].邵伟、吴钰洁等以豆制品生产废水为主要原料，大量培养热带假丝酵母，实现了豆制品生产废水资源化利用的目的[3].代小江等利用微生物混合培养物生产沙棘果渣单细胞蛋白[4].宁夏大学李亚蕾、杨波等用玉米秸秆生产单细胞蛋白，并研究了菌种选育及发酵条件的优化[5].王军、郝新艳等用苎麻生物脱胶废水生产热带假丝酵母单细胞蛋白，从而处理了苎麻废水[6].王定昌、赖荣婷的研究表明酵母菌含有极丰富的蛋白质，具有人体所必需的八种氨基酸和B族维生素、维生素D、脂肪、粗纤维、碳水化合物、矿物元素等，同时还含有丰富的酶系统和生理活性物质[7].因此，利用有机废水发酵生产酵母单细胞蛋白，不仅能为人类提供营养丰富的单细胞蛋白产品，还可以净化有机废水，实现废水资源化利用，具有一定的经济效益和环境效益[8].

本实验以实验室自筛红酵母-2为发酵菌种，豆腐黄水为培养基，在不添加任何其他营养成分的条件下，通过设计正交实验对发酵条件进行优化，旨在为豆制品废水的综合利用提供参考.

1 实验部分

1.1 实验材料与仪器

豆腐黄水，由某豆腐作坊生产水豆腐所得；菌株，实验室冰箱保藏酵母菌，编号为酵母红-2.

麦芽糖、硝酸钠、氯化钾、氯化钠、硫酸镁、硫酸亚铁、氢氧化钠、硫酸铵、磷酸二氢钾等均为分析纯；酵母膏；琼脂. 精科FA-1004电子天平；上海阳光SW-CJ-1B超净工作台；申安LD2x-50KB灭菌器；湖南凯达低速离心机TD5A；美菱冰箱BCD-205A；国华SHA-B恒温振荡箱；上海精宏电热恒温鼓风干燥箱DHG-9240A；上海天美紫外可见分光光度计UV1100.

1.2 培养基

种子培养基(质量分数)：麦芽糖5 %，磷酸二氢钾0.25 %，磷酸氢二钠0.05 %，硫酸铵0.1 %，硫酸镁0.1 %，硫酸亚铁0.05 %，酵母膏0.05 %.

发酵培养基：取豆腐坊的豆腐黄水经沉淀后，取上清液按一定比例加自来水配制而成.

1.3 实验方法

1.3.1 酵母菌种子液的制备及发酵培养方法

种子液的制备：取冰箱活化保存的酵母菌，用接种环接两环于50 mL种子培养基中，在摇床转速为150 r/min、28 ℃恒温振荡培养18 h，制成种子液.

发酵条件：250 mL三角烧瓶装入50 mL一定体积分数的豆腐黄水为发酵培养基，无需调整培养基pH，按9 %的接种量接入种子液，在摇床转速为150 r/min、28 ℃振荡培养一定时间，发酵液离心测定生物量.

正交实验设计：通过单因素实验，选择豆腐黄水浓度、温度、接种量、装液量4个影响较大的因素作为正交试验的因素，选取L9(34)正交表，对发酵条件进行优化，因素水平表见表1.

表1 因素水平表

1.3.2 酵母菌生长曲线及发酵时间的测定

将冰箱活化保存的酵母红-2菌接两环于种子培养基中，在25 ℃恒温振荡培养约24 h，每隔2 h取发酵液在595 nm处测定其吸光度值，绘制出生长曲线.按1.3.1发酵条件取体积分数为70 %的豆腐黄水为发酵培养基，发酵培养42 h,每2 h测定一次生物量，考察培养时间对单细胞蛋白产量的影响.

1.3.3 细胞生物量的测定

将发酵液转入离心管中，以4 000 r/min离心20 min，自来水冲洗2次，去上清液得湿菌体；将湿菌体于60 ℃烘干24 h，达质量恒定，电子天平称量，计算单细胞蛋白产量.

单细胞蛋白产量(g/L)=生物量干质量(g)/发酵液体积(L)

1.3.4 蛋白质含量测定

取50 mL发酵液，4 000 r/min离心20 min，收集酵母细胞.用质量分数为0.9 %氯化钠洗涤细胞2次，离心得菌体细胞.将洗涤过的细胞配制成0.01 g/mL的细胞悬液，置于超声波破碎仪中，将超声波破碎仪的功率调到额定的80 %进行破碎细胞30 min,然后在-19 ℃的冰箱中冷冻30 min,用超声波加冷冻组合处理菌体2次.随后取0.2 mL样品加入0.8 mL的蒸馏水、5 mL的考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2 min，然后在595 nm处测定其吸光度值[9].采用考马斯亮蓝法，以牛血清蛋白标准溶液为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线[10].吸光度与蛋白质量的关系为：

Y=0.007 2x+0.010 7

(1)

R2=0.999 1

单细胞蛋白含水量=[(生物量湿质量-生物量干质量)/生物量湿质量]×100 %

(2)

蛋白质含量( %)=x·10-2×(1-含水量)

(3)

式中：Y—吸光度值；x—样品中蛋白质量[11-13]，μg.

2 结果与讨论

2.1 单因素实验优化酵母红-2发酵生产单细胞蛋白条件

2.1.1 酵母红-2生长曲线的测定

酵母菌的生长周期分为4个时期：调整期，对数期，稳定期，衰亡期.通过测定其生长曲线来探究酵母菌的生长特性，确定最佳制种时间，结果如图1.由图1可以看出：酵母红-2生长曲线整体上符合S型曲线，前1～15 h酵母的OD值缓慢增加，为酵母菌的调整期；在15～20 h过程中OD值呈现对数增加的趋势，为酵母菌的对数生长期；到22 h后生物量达到最大值，然后开始衰亡，以后为酵母菌的衰亡期.所以，在种子液的制备中取培养18 h的发酵液作为种子液.

图1 酵母红-2生长曲线

2.1.2 培养时间对酵母菌发酵的影响

按照9 %的接种量将种子液接种于体积分数为70 %的豆腐黄水液体发酵培养基中，在摇床转速为150 r/min、28 ℃下振荡培养42 h，考察培养时间对单细胞蛋白产量的影响.由图2可以看出：酵母生长曲线整体上符合S型曲线，前0～15 h为酵母的延滞期，生物量基本保持不变.和图1相比，延滞期相对延长，可能与发酵培养基碳源、氮源和种子培养基不同有关，不利于酵母菌种的生长.15～36 h过程中生物量呈快速增加趋势，到36 h后生物量基本保持不变，到达稳定期，所以，在以后发酵试验中，发酵时间选择36 h.

图2 培养时间对单细胞蛋白产量的影响

2.1.3 豆腐黄水体积分数对酵母菌发酵的影响

取一定体积分数的豆腐黄水为发酵培养基，按1.3.1实验方法中的发酵条件，发酵培养36 h，考察豆腐黄水体积分数对其生物量的影响.结果见图3.从图3可以看出：豆腐黄水体积分数对酵母菌发酵生产单细胞蛋白有一定的影响，在一定浓度范围内生物量随豆腐黄水浓度的升高而呈上升的趋势.豆腐黄水能为菌体生长提供所需的碳源、氮源，当豆腐黄水体积分数太低时，发酵培养基的营养物质不足以满足酵母的生长，导致生物量产量不高；当豆腐黄水体积分数太高时，达到100 %时，发酵培养基黏稠，反而不利于了酵母的生长，影响单细胞蛋白产量.因此，选择质量分数为80 %的豆腐黄水作为发酵培养基.

图3 豆腐黄水体积分数对单细胞蛋白产量的影响

2.1.4 培养温度对酵母菌发酵的影响

以体积分数为80 %的豆腐黄水为培养基，按1.3.1实验方法发酵培养，考察培养温度对其发酵的影响.结果如图4.

图4 发酵温度对单细胞蛋白产量的影响

从图4可以看出：温度对酵母发酵有显著的影响.温度可以影响菌体细胞内酶的活性，进而影响到蛋白质的合成.每种菌都有自己的最适温度，由图4可以看出酵母红-2的最适生长温度为30 ℃.

2.1.5 接种量对酵母菌发酵的影响

按1.3.1实验方法，以体积分数为80 %的豆腐黄水为培养基，按不同的接种量接入种子液，30 ℃条件发酵培养，考察接种量对其发酵的影响.结果如图5.

图5 接种量对单细胞蛋白产量的影响

从图5可以看出：接种量对酵母的生长也有较大的影响.随着接种量的增大，单细胞蛋白产量也逐渐增大.这是因为接种量过少，细胞量不足，易造成生长延迟，而增大接种量能够缩短延迟期.但当接种量超过8 %时，虽然可使发酵周期缩短，但由于养分消耗过快，也不利于微生物细胞持续增长和产物合成，使得单细胞产量下降.因此，选择8 %为最适接种量.

2.1.6 发酵液初始pH值对酵母菌发酵的影响

以体积分数为80 %的豆腐黄水为培养基，按8 %的接种量接入种子液，30 ℃条件发酵培养36 h，考察pH值对其生物量的影响.结果如图6.

图6 pH值对单细胞蛋白产量的影响

酸性环境适合于酵母菌的生长，而豆腐黄水的pH值又在4～5，因此，选择不同的酸性环境来考察酵母的最佳生长状况.由图6实验结果可以看出：不同的发酵液初始pH值对酵母生长的影响不大，因此，选择豆腐黄水的自然pH值为4.5.

2.2 正交实验优化酵母菌发酵生产单细胞蛋白条件

按表1进行正交实验，在摇床转速为150 r/min振荡培养36 h，正交实验结果如表2.

表2 正交实验结果

表中各因素水平K值的均值表示该因素在各水平值的平均结果，K值越大，代表该因素在各个水平时的评价结果越好，由此可判断各因素最佳水平值的大小.由实验结果可以看出：理论最佳发酵条件为：A2B2C1D2，即豆腐黄水体积分数70 %，培养温度30 ℃，接种量7 %，装液量50 mL.在此条件下进行3组验证性实验，得出单细胞蛋白的平均产量为4.15 g/L.

表中极差代表该因素对实验结果的影响程度，极差越大，表明该因素对结果的影响程度越大.通过对表1的极差分析可知，影响单细胞蛋白产量的因素由大到小次序为：装液量>培养温度>豆腐黄水浓度>接种量.

2.3 发酵生产的酵母菌单细胞蛋白含量的测定

按1.3.4实验方法，用超声波加冷冻组合处理2次菌体后，在595 nm下测定吸光度值为0.791，带入Y=0.007 2x+0.010 7 ，蛋白量为108.375 mg/L，从而测得菌体蛋白质量分数可以达到27 %以上.

3 结 论

以实验室保藏酵母菌酵母红-2为发酵菌株，在豆腐黄水中进行发酵培养菌体，并对菌体所含蛋白进行了测定，得出以下结论：

确定发酵生产单细胞蛋白的最佳条件：豆腐黄水体积分数为70 %，培养温度30 ℃，接种量7 %，装液量250 mL三角瓶装培养基50 mL，在该条件下发酵培养36 h后酵母单细胞蛋白的产量为4.15 g/L，其菌体蛋白含量达到27 %以上.影响单细胞蛋白产量的因素由大到小次序为：装液量>培养温度>豆腐黄水浓度>接种量.

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[3] 邵伟,吴钰洁,熊泽,等.利用豆制品生产废水生产单细胞蛋白的研究[J].食品科技,2005(10):5-6.

[4] 代小江,王礼德,贺锡勤,等.利用微生物混合培养物生产沙棘果渣单细胞蛋白[J].微生物学通报,1995,22(5):267-270.

[5] 李亚蕾，杨波，罗瑞明.用玉米秸秆生产单细胞蛋白的菌种选育及发酵工艺[J].宁夏大学学报,2008,29(4)：353-357.

[6] 王军,郝新艳,殷朝敏,等.用苎麻生物脱胶废水生产热带假丝酵母单细胞蛋白[J].化工环保,2012,32(3):255-260.

[7] 王定昌，赖荣婷.酵母的用途[J].粮油食品科技，2002(1)：12-13.

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[11]全桂静,雷晓燕，李辉.微生物学实验指导[M].北京:化学工业出版社,2010：121.

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Single-cell Protein by Using Bean Curb-farm Waste Water

LIU Gui-ping, ZHAO Qi-rui, YANG He-long

(Shenyang University of Chemical Technology, Shenyang 110142, China)

With curb-farm waste water as the liquid medium and yeast red-two as the fermentation strain,the influence of different culture conditions on yeast fermentation to produce single cell protein is studied.By orthogonal experiments it is determined that the best condition for fermentation is that with curb-farm water concentration of 70 %,temperature of 30 ℃,inoculation amount of 7 %,liquid volume of 50 mL/250 mL,single-cell protein production can reach 4.15 g/L,and protein content 27 %.

bean curb-farm waste water； yeast； fermentation； single-cell protein

2013-10-08

国家及辽宁省大学生创新创业训练计划项目(201310149014)

刘桂萍(1960-)，女，吉林镇赉人，教授，主要从事环境污染生物治理与废物资源化利用方面的研究.

2095-2198(2015)02-0113-05

10.3969/j.issn.2095-2198.2015.02.004

TQ926.3

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