磷酸化预处理对花生蛋白酶解特性的影响

金华丽，郑静静

（河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001）

0 引言

花生粕是花生仁经脱油后的副产物，它含有丰富的蛋白质和膳食纤维[1]，具有较高的利用价值，但目前我国脱油后的花生粕主要作为饲料使用，极少用于食品或其他工业生产[2]，从而造成了花生蛋白的极大浪费.这主要是因为目前我国花生油提取大多采用热压榨工艺而导致花生蛋白变性，营养价值和功能特性降低，从而限制了花生蛋白在食品工业上的应用[3-4].因此，通过对花生蛋白进行改性，开发利用花生变性蛋白，对提高花生蛋白在食品及工业上的应用具有重要意义[5].目前磷酸化是花生蛋白改性的有效方法，三聚磷酸钠是我国国标允许使用的食品添加剂，使用三聚磷酸钠对花生蛋白进行预处理也是目前应用最多的方法，熊柳等[6]及潘秋琴等[7]采用三聚磷酸钠对花生分离蛋白进行磷酸化改性后，花生分离蛋白的吸油性、吸水性、溶解性、乳化性和泡沫稳定性均有显著提高.

为了改善花生蛋白酶解特性，提高花生蛋白利用率，作者用三聚磷酸钠对其进行预处理，研究了磷酸化预处理对花生蛋白酶解特性的影响.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高温花生粕：市售；碱性蛋白酶、风味蛋白酶：诺维信公司（NOVO）；三聚磷酸钠（STP）：天津市瑞金化学品有限公司；其他试剂均为分析纯.

1.2 仪器与设备

pHS-25B 型pH 计:上海精科仪器；GL-80 恒温加热磁力搅拌器:巩义市予华仪器设备有限责任公司；TDL-5-A 台式离心分离机:上海安亭科学仪器厂；SHA-C 恒温水浴振荡器:金坛市华峰仪器有限公司；AY-120 电子分析天平:日本SHIMADZU 公司；HH-2 数显恒温水浴锅:国华电器有限公司.

1.3 试验方法

1.3.1 花生蛋白酶解液的制备

称取5.007 02 g 花生粕于烧杯中，加入50 mL蒸馏水搅拌混匀，在磁力搅拌器中先用1 mol/L NaOH 溶液调至pH 接近8 时，换用0.1 mol/L NaOH 溶液将溶液的pH 调至8.0，在相应酶解温度下预热10 min，加酶之后，放在恒温水浴振荡器内酶解，酶解后立即放入沸水浴中灭酶10 min，使酶变性失活，酶解液冷却至室温后，在4 000 r/min 的转速下离心20 min，取15 mL 上清液测定花生蛋白的水解度和蛋白质提取率.

1.3.2 磷酸化处理

称取5.003 4 g 花生粕于烧杯中，量取50 mL蒸馏水并搅拌混匀，再加入定量的三聚磷酸钠试剂，用1 mol/L NaOH 调溶液的pH 值至8.0，在30℃下预处理20 min 后将溶液的pH 调至酶解时最适的pH，酶解过程在碱性蛋白酶和风味蛋白酶酶解花生蛋白的最适条件下进行，酶解后离心，取上清液测定水解度和蛋白质提取率.

1.3.3 水解度的测定

式中：V1、V0分别为样品和空白消耗NaOH 标准溶液的体积（mL）；C1为NaOH 标准溶液的浓度（mol/L）；C2为花生粕溶液的质量浓度（g/mL）；V2为花生蛋白酶解液体积（mL）；ω 为花生粕中蛋白质含量（%）；7.13 为每克花生蛋白中肽键的毫摩尔数（mmol/g）.

1.3.4 蛋白质提取率的测定

2 结果与讨论

2.1 双酶复合酶解花生蛋白的最佳条件

根据课题组前期试验成果，以水解度为指标，通过正交试验得到双酶复合酶解花生蛋白的最佳条件为酶解时间3 h、pH 9.0、温度55 ℃、酶比例（碱性∶风味）为2∶3、总酶浓度5.0×103U/g、底物浓度5%.

2.2 磷酸化处理时各因素对花生蛋白酶解特性的影响

在2.1 最佳酶解条件下，考察了磷酸化过程中，STP 添加量、处理时间、温度和pH 对花生蛋白酶解特性的影响.

2.2.1 STP 添加量对花生蛋白酶解特性的影响

研究了磷酸化处理过程中，STP 添加量分别为0、2%、4%、6%、8%、10%、12%时，双酶酶解花生蛋白水解度及蛋白质提取率的变化.

由图1 可以看出：当STP 添加量低于8%时，花生蛋白的水解度及蛋白提取率均随着STP 添加量的增加呈上升趋势；当STP 添加量高于8% 时，花生蛋白的水解度及蛋白提取率随STP 添加量增加而降低.主要是因为当STP 添加量较少时，花生蛋白结构中引进了磷酸根基团，使分子之间的电负性增加，蛋白之间的斥力减小，花生蛋白的溶解性进而得到改善，因此花生蛋白水解度及蛋白提取率呈上升的趋势；而当STP 添加过量时，溶液中离子浓度增高及反应环境的改变会造成花生蛋白的变性，水解度及蛋白提取率开始下降.所以，确定STP 添加量为8%.

图1 STP 添加量对花生蛋白水解度及蛋白提取率的影响Fig.1 The effect of STP amount on hydrolysis degree and yield of the peanut protein

2.2.2 磷酸化处理时间对花生蛋白酶解特性的影响

研究了磷酸化预处理时间分别为10、20、30、60、120、180、240 min 的条件下，双酶酶解花生蛋白水解度和蛋白提取率的变化.

图2 处理时间对花生蛋白水解度及蛋白提取率的影响Fig.2 The effect of processing time on hydrolysis degree and yield of the peanut protein

由图2 可以看出：在预处理20 min 时，水解度为13.68%，蛋白提取率为75.78%，均达到最大值，此后随着预处理时间的延长，水解度和蛋白提取率并未有所增加.这是因为磷酸化预处理时磷酸基团的引入在前20 min 内基本完成.因此，确定磷酸化预处理最佳时间为20 min.

2.2.3 磷酸化处理温度对花生蛋白酶解特性的影响

研究了磷酸化预处理温度分别在25、30、35、40、45、50 ℃条件下，双酶酶解花生蛋白水解度和蛋白提取率的变化.

图3 处理温度对花生蛋白水解度及蛋白提取率的影响Fig.3 The effect of processing temperature on hydrolysis degree and yield of the peanut protein

由图3 可以看出，预处理的温度在30 ℃时水解度为14.00%，蛋白提取率为73.72%，都达到最大值.在达到最佳处理温度之前，随着温度升高，蛋白分子运动速度加快，使磷酸基团与氨基酸残基的反应速度相应增加.但温度过高时，会破坏蛋白质的结构，导致其变性，水解度和蛋白质的提取率也相应下降.图3 中温度升高到50 ℃时，水解度稍微升高，可能是由于该温度接近蛋白质酶解时的温度，预处理过程中也发生了酶解，相当于酶解时间延长了.因此，综合水解度和蛋白提取率变化规律，确定磷酸化预处理温度为30 ℃.

2.2.4 磷酸化预处理pH 对双酶酶解花生蛋白酶解特性的影响

研究了磷酸化预处理pH 分别为7、8、9、10、11 条件下，双酶酶解花生蛋白水解度及蛋白提取率的变化.

图4 pH 对花生蛋白水解度及蛋白提取率的影响Fig.4 The effect of pH on hydrolysis degree and yield of the peanut protein

由图4 可以看出：在pH 值为8 时，水解度为13.52%，蛋白提取率为73.72%，均达到最大值.由于STP 可以和蛋白质的氨基和羟基发生反应，且在碱性环境条件下，蛋白质的氨基酸残基活性较强，反应也较容易进行，引入的磷酸基团比较多，水解度比较高.但当pH 过高时，花生蛋白会变性失活，不再或不易与磷酸基团发生反应，水解度和蛋白提取率均降低或无明显变化.所以，确定磷酸化预处理pH 为8.0.

2.3 双酶酶解磷酸化的正交试验

根据双酶单因素试验可知，影响蛋白酶解的因素主要有STP 添加量、温度、pH 及时间.采用L16（44）正交表，以蛋白水解度和蛋白提取率为评价指标，考察4 个因素对蛋白酶解特性的影响.正交试验因素与水平见表1，试验结果见表2.

由表2 可知：在双酶酶解最适条件的基础上，对花生粕进行磷酸化预处理，水解度的最适预处理条件为A2B2C1D2，蛋白质提取率的最适预处理条件为A2B2C2D2.当因素C 取C1时，水解度仅提高了0.7%，而蛋白提取率却降低了2.7%，故选C2.即磷酸化预处理蛋白最佳组合为：STP 添加量为8%，预处理pH 为8.0，磷酸化处理温度30 ℃，预处理时间20 min.

表1 正交试验因素与水平Table 1 The factor and levels of the orthogonal test

表2 正交试验结果Table 2 The orthogonal test results %

2.4 双酶酶解花生蛋白过程中水解度及蛋白提取率的变化规律

在2.3 得出的最佳条件下对花生蛋白进行预处理，与未处理的花生蛋白进行对比，分析其酶解过程中水解度和蛋白提取率的变化规律.

从图5 和图6 可以看出，磷酸化处理和未处理的花生蛋白的水解度和蛋白提取率的变化规律都是随酶解时间的增加而升高.在同一时刻，磷酸化处理后的花生蛋白的水解度和蛋白提取率较未处理的均有提高.

酶解开始时，由于酶处于最适反应条件，且浓度比较高，因此酶解反应在开始时增加速率比较快；但随着反应的进行，由于底物浓度的下降且酶解产物对酶的抑制以及反应环境pH 的改变，抑制酶解的进行，所以酶解速率下降甚至停滞，如图5所示，花生蛋白酶解过程中水解度在180 min 后增加不明显甚至停滞.而在酶解过程中，酶只是催化蛋白质分子中肽键的断裂使蛋白质分子质量降低以及离子性基团的增加，酶本身并不参加反应，所以酶解过程中蛋白提取率的变化应该与其水解度的变化规律相同，如图6 所示，花生蛋白酶解过程中蛋白提取率在180 min 后增加不明显甚至下降.

图5 花生蛋白酶解过程中水解度的变化Fig.5 Changes of hydrolysis degree during peanut protein protrolysis

图6 花生蛋白水解过程中蛋白提取率的变化Fig.6 Changes of protein extraction rate during peanut protein protrolysis

3 结论

试验确定了磷酸化预处理最适条件为：STP 的添加量8%、pH 为8.0、温度30 ℃、磷酸化预处理的时间为20 min，在此条件下，花生蛋白水解度为14.10%，蛋白提取率为73.72%.

经过磷酸化预处理和未处理的花生蛋白酶解过程水解度和蛋白提取率的变化规律是一致的，同一时刻磷酸化预处理后的花生蛋白的水解度和蛋白提取率都有所提高，因此认为，磷酸化预处理是提高花生蛋白酶解的有效方法.

［1］Batal A，Dale N，Cafe M.Nutrient composition of peanut meal［J］.Journal of Applied Poultry Research，2005，14:254-257.

［2］刘大川，张维农，胡小泓.花生蛋白制备工艺和功能特性的研究［J］.武汉工业学院学报，2007（4）:1-3.

［3］Yu J M,Ahmedna M,Goktepe I.Peanut protein concentrate:Production and functional properties as affected by processing［J］.Food Chemistry,2007,103:121-129.

［4］周瑞宝，黄凤洪.蛋白质酶水解物功能特性及其在食品工业上的应用［J］.粮食与油脂，2003（5）:16-18.

［5］董新红，赵谋明，蒋跃明.花生蛋白改性的研究进展［J］.中国粮油学报，2011，26：109-117.

［6］熊柳，孙高飞，王建化.花生分离蛋白磷酸化改性研究［J］.食品科学，2010，31（10）：35-41.

［7］潘秋琴，沈蓓英，程霜.花生蛋白质的磷酸化改性［J］.中国油脂，1997，22（1）:25-27.