VEGF、P53及C-erbB2蛋白在卵巢上皮性肿瘤中的表达及临床意义

赵娟　陈隈陟　马唯　仝亚红　刘彤　刘凤阁

作者单位: 101100北京市，首都医科大学附属北京潞河医院妇科(赵娟、陈隈陟、马唯、仝亚红)，病理科(刘彤、刘凤阁)

VEGF、P53及C-erbB2蛋白在卵巢上皮性肿瘤中的表达及临床意义

赵娟陈隈陟马唯仝亚红刘彤刘凤阁

作者单位: 101100北京市，首都医科大学附属北京潞河医院妇科(赵娟、陈隈陟、马唯、仝亚红)，病理科(刘彤、刘凤阁)

【摘要】目的观察卵巢上皮性肿瘤组织中血管内皮生长因子(VEGF)、抑癌基因P53及人表皮生长因子受体2 (C-erbB2)蛋白的表达情况，探讨三者在卵巢肿瘤发生发展中的作用。方法采用免疫组化SP法检测40例正常卵巢、45例良性、30例交界性、65例卵巢上皮癌中VEGF、P53及C-erbB2蛋白的表达。结果正常卵巢、良性、交界性、卵巢上皮癌中VEGF蛋白的表达率分别为17.50%(7/40)，24.44%(11/45)，63.33% (19/30)和73.85% (48/65)，差异有统计学意义(P＜0.05)。卵巢癌组VEGF蛋白的表达与肿瘤的临床分期差异有统计学意义(P＜0.05)，但与肿瘤的病理类型及组织分化程度差异无统计学意义(P＞0.05);正常卵巢、良性、交界性、卵巢上皮癌中P53蛋白的表达率分别为20.00%(8/40)、24.44%(11/45)、56.67%(17/30)、56.92% (37/65)，4组中C-erbB2蛋白的表达率分别为15.00%(6/40)、15.56%(7/45)、50.00%(15/30)、67.69%(44/65)，4组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。C-erbB2蛋白表达与肿瘤的临床分期差异有统计学意义(P＜0.05)。VEGF蛋白在卵巢上皮癌中的表达与P53及C-erbB2蛋白表达呈正相关(r值分别为0.44和0.23，两者均P＜0.05)，共同促进卵巢癌发生发展。结论VEGF、P53 及C-erbB2蛋白在卵巢癌发生、发展中起重要作用，P53及C-erbB2在癌基因方面促进血管生成因子VEGF的发生，共同促进卵巢肿瘤的发生发展。三种蛋白的联合检测对卵巢肿瘤的诊断、治疗及预后评价有一定的指导意义。

【关键词】VEGF; P53 ; C-erbB2蛋白;卵巢上皮性肿瘤;免疫组织化学

E-mail: hqhvaczj1981@126.com

卵巢癌是居妇科恶性肿瘤中病死率的首位，就诊时半数以上患者已处于中晚期，因此早期诊断卵巢癌一直是困扰妇产科医生的难题。肿瘤的发生多与肿瘤内新生血管的大量生成有关，血管上皮生长因子(vascular epithelial growht factor，VEGF)亦称血管通透因子(vascular permeability factor，VPF)是一种多功能的细胞因子，能刺激血管内皮细胞分裂增殖，促进血管形成及增加血管通透性，从而促进肿瘤的生长增殖。P53 及C-erbB2蛋白均为癌基因，两者正常情况下属于沉默状态，在恶性肿瘤组织中该两种蛋白被激活。我们共同研究癌基因P53及C-erbB2蛋白与VEGF的关系，或许两种基因的激活及蛋白的大量表达，是通过刺激内皮细胞分裂增殖及促进肿瘤血管生成，而促进肿瘤细胞的生长增殖。故本文通过免疫组化方法检测卵巢肿瘤中VEGF、P53及C-erbB2蛋白的表达，从而进一步探讨三者在卵巢肿瘤中的作用。进一步探讨其在卵巢癌发生发展中的重要作用，希望对卵巢肿瘤的诊断、治疗及预后评价提供一定的指导意义。

1　资料与方法

1.1一般资料选择北京市潞河医院2007年7月至2013年6月手术切除卵巢组织标本的蜡块180例。其中: (1)正常卵巢组40例; (2)卵巢上皮性良性肿瘤组45例; (3)卵巢上皮性交界性肿瘤30例; (4)卵巢上皮性恶性肿瘤组65例，所有病例均经病理确诊。卵巢上皮性恶性肿瘤组按国际妇产科联盟(FIGO 2000)修订的临床分期标准进行分期:Ⅰ期10例，Ⅱ期15例，Ⅲ期30例，Ⅳ期10例;按病理组织学类型可分为:卵巢浆液性囊腺癌29例，黏液性囊腺癌15例，子宫内膜样癌9例，透明细胞癌5例，其他类型7例;分化程度:高分化14例，中分化21例，低分化30例。所有患者术前均未接受放疗或化疗。病理切片均由2位以上高年资病理医师阅片诊断。

1.2免疫组化方法检测标本中VEGF、P53及C-erbB2蛋白所有标本经10%甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片，同时进行苏木精-伊红染色(HE)及免疫组化染色。免疫组化采用S-P法(链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法)，免疫组化操作按说明书进行。兔抗人单克隆抗体VEGF，鼠抗人单克隆抗体P53，兔抗人单克隆抗体C-erbB2购自于北京中山生物制品公司。采用TBS缓冲液代替一抗作阴性对照。

1.3结果判断VEGF阳性染色为细胞浆着色，P53阳性染色为细胞核中出现棕黄色颗粒; C-erbB2蛋白以细胞膜呈清晰的棕色着色为阳性，胞质内和核内着色均不作阳性判断依据。计算10个代表性的高倍视野下阳性细胞数占总细胞数的百分比，或观察细胞膜和细胞质的染色情况得出结果。VEGF无阳性细胞为阴性(－)，阳性细胞＜25%为(+ )、25%～50%为(+ + )、＞50%为(+ + + ); P53无阳性细胞为阴性(一)，阳性细胞＜30%为(+ )、30%～50%为(+ + )、＞50%为(+ + + ); C-erbB2蛋白阳性反应切片中棕色颗粒主要出现在细胞膜，其中表达阴性指:胞膜或胞质均未见染色，或阳性细胞比例＜10%;弱阳性(+ )指:阳性细胞比例10%～30%;中度阳性(+ + )指:阳性细胞比例31%～50%;强阳性(+ + + ):阳性细胞数＞50%。

1.4统计学分析应用SPSS 17.0统计软件，计数资料采用χ2检验和fisher确切概率法，相关性分析采用Spearman等级相关检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1VEGF、P53及C-erbB2蛋白在正常卵巢和不同卵巢肿瘤组织中的表达VEGF、P53及C-erbB2蛋白在正常卵巢组织和卵巢良性肿瘤中的表达差异无统计学意义(P＞0.05)，在交界性肿瘤与恶性肿瘤中的表达差异无统计学意义(P＞0.05)。正常卵巢和卵巢良性肿瘤中的表达与交界性肿瘤和恶性肿瘤中的表达差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1，图1～6。

表1　VEGF、P53及C-erbB2蛋白在正常卵巢和不同卵巢上皮性肿瘤组织中的表达　例(%)

2.2VEGF、P53及C-erbB2蛋白在卵巢癌中的表达与临床病理特征的关系卵巢癌组内VEGF、P53及C-erbB2三种蛋白的表达与肿瘤的病理类型及组织分化程度均无明显统计学意义(P＞0.05)，但VEGF和C-erbB2蛋白表达与肿瘤的临床分期具有明显差异(P＜0.05)，P53蛋白表达与肿瘤的临床分期无明显差异(P＞0.05)。见表2。

2.3VEGF、P53及C-erbB2蛋白在卵巢癌中表达的相关性分析上皮性卵巢癌组织中VEGF蛋白按表达强度分为四个等级，P53及C-erbB2蛋白分为阴性、阳性两组，表达的相关性采用Spearman等级相关分析法分析，结果显示VEGF与P53蛋白的表达呈正相关(r =0.44，P＜0.05)，VEGF与C-erbB2蛋白的表达呈正相关(r =0.23，P＜0.05)。

3　讨论

众所周知，卵巢癌的特点是生长速度快、具有浸润性及盆腹腔内播散种植。新生血管的形成是卵巢癌细胞生长的基础，同时又是肿瘤转移的重要途径。血管形成是多种因素相互作用、多步骤协调发展的结果，其与细胞增殖、分化异常、血管生成及某些基因的异常表达有关。在众多与肿瘤密切相关的蛋白表达中，VEGF、P53及C-erbB2是较为常见的，但多数文献多分别研究其与卵巢癌的关系，本研究通过对三者的共同研究，以其进一步探讨卵巢癌发生发展的过程。

VEGF是由二硫键连接的糖蛋白二聚体，是一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素，些许研究表明，其主要有以下生物学功能: (1)增强血管通透性，是已知最强的血管通透剂［1］; (2)促进血管形成能促进内皮细胞有丝分裂，同时诱导抗凋亡因子bcl-2等的表达［2］，使内皮细胞增殖加速而凋亡减少。VEGF是否还有其他生物学功能促进血管生成?许多学者研究，一些癌基因的表达增高也明显促进肿瘤的生长增殖［3］。遂本研究共同研究VEGF、P53及C-erbB2蛋白，后两种蛋白分别为抑癌基因及原癌基因表达产物，共同研究三者，为VEGF促进血管形成，增强肿瘤侵袭性提供了另一理论基础。

图1　VEGF表达(+ + + )卵巢浆液性腺癌(中分化)(SP×100)

图2　P53表达(+ + + )卵巢浆液性腺癌(中低分化)(SP×100)

图3　C-erbB2表达(+ + + )卵巢浆液性腺癌(中分化)(SP×100)

图4　卵巢浆液性腺癌(低分化)VEGF表达阳性(SP×100)

图5　卵巢浆液性腺癌(低分化)P53表达阳性(SP×100)

图6　卵巢浆液性腺癌(低分化)C－erbB2表达阳性(SP×100)

表2　VEGF、P53及C-erbB2蛋白在卵巢癌中的表达与临床病例特征的关系　例(%)

表3　上皮性卵巢癌组织中VEGF、P53及C-erbB2表达的关系例

我们研究了正常卵巢组织，良性、交界性和恶性上皮性卵巢肿瘤组织中VEGF的表达情况，结果显示:交界性及恶性肿瘤中VEGF阳性表达率明显高于良性肿瘤及正常卵巢组织(P＜0.05)，VEGF蛋白在不同病理类型、不同分化程度的卵巢癌中的阳性表达无统计学差异(P＞0.05)，而与临床分期具有明显统计学意义(P＜0.05)，与众多学者的研究基本相似［4］。

同时，近年来我们在癌基因方面进行了大量不间断研究，其中P53及C-erbB2蛋白是最重要的两种。p53基因是迄今发现的与人类肿瘤相关性最高的基因，位于人17号染色体短臂上，基因组DNA长约20kb，分为野生型和突变型。野生型p53是一种抑癌基因，是细胞生长的“监控器”，能诱导终末分化，维持基因稳定，触发衰老和诱导细胞凋亡，是负生长调控因子;而突变型不但无抑癌功能，还能抑制野生型活性，从而引起细胞的转化，促进细胞癌变。多种恶性肿瘤中同时检测到VEGF及P53的高表达，如乳腺癌、肺癌等［5、6］。人C-erbB2基因又称为neu或Her-2或Her-2/neu密码，定位于17g2l，编码185-190kd的糖蛋白，是具有酪氨酸激酶活性的细胞膜受体，能激活C-erbB2基因编码蛋白诱导的酪氨酸激酶活性，传递调节上皮细胞生长的分化信号。在许多肿瘤中都发现有C-erbB2的异常表达，表明该基因可能与肿瘤的形成和发生有关，同时有学者在鼻咽癌中检测P53及C-erbB2的高表达［7］。本研究结果提示: P53及C-erbB2蛋白在正常卵巢、良性肿瘤中的表达明显低于交界性、卵巢上皮癌中表达，并具有统计学意义(P＜0.05);卵巢癌组内P53及C-erbB2蛋白的表达与肿瘤的病理类型及组织的分化程度无明显差异(P＞0.05)，C-erbB2蛋白表达与肿瘤的临床分期具有明显差异(P ＜0.05)，但P53蛋白的表达与临床分期无明显差异。通过该研究推测: P53及C-erbB2蛋白在卵巢恶性组织中呈高表达状态，表明癌基因的高表达在卵巢癌发生过程中是一普遍现象，其可作为卵巢良、恶性肿瘤的判断标志之一。而晚期患者的C-erbB2表达明显高于早期期患者，表明上皮性卵巢癌的期别越晚，C-erbB2的表达越强，提示原癌基因C-erbB2蛋白的表达促进卵巢癌发展，故对卵巢癌的诊断及判断预后有重要作用。

在相关性分析中，VEGF蛋白在卵巢上皮癌中的表达与P53及C-erbB2蛋白表达具有正相关性(r =0.44、0.23，P＜0.05)，共同促进卵巢癌发生发展。由此推测原癌基因的扩增及抑癌基因的突变增殖对血管形成具有共同促进作用，或许可以成为VEGF促进血管形成的另一机制。

卵巢肿瘤的发生发展是一个复杂的过程，通过对各种蛋白的不断研究，以期更好的预防，尽早发现，准确治疗，延长预后。VEGF、P53及C-erbB2蛋白可作为预测卵巢癌恶性生物行为及预后的重要指标。不仅有助于指导卵巢癌的临床诊断和治疗，也为卵巢癌的分子生物学治疗提供了理论依据。

参考文献

1 Jesmin S，Zaedi S，Islam AM，et al.Time-dependent alterations of VEGF and its signaling molecules in acute lung injury in a rat model of sepsis.Inflammation，2012，35: 484-500.

2 Li W，Jiang D.Effect of resveratrol on bcl-2 and VEGF expression in oxygen-induced retinopathy of prematurity.J Pediatr Ophthalmol Strabismus，2012，49: 230-235.

3 Khromova NV，Kopnin PB，Stepanova EV，et al.p53 hot-spot mutants increase tumor vascularization via ROS-mediated activation of the HIF1/VEGF-A pathway.Cancer Lett，2009，276: 143-151.

4 Crasta JA，Mishra S，Vallikad E，et al.Ovarian serous carcinoma: relationship of p53 and bcl-2 with tumor angiogenesis and VEGF expression.Int J Gynecol Pathol，2011，30: 521-526.

5 Noranizah W，Siti-Aishah MA，Munirah MA，et al.Immunohistochemical expression of vascular endothelial growth factor (VEGF)and p53 in breast lesions.Clin Ter，2010，161: 129-137.

6 Bircan A，Bircan S，Kapucuoglu N，et al.Maspin，VEGF and p53 expression in small biopsies of primary advanced lung cancer and relationship with clinicopathologic parameters.Pathol Oncol Res，2010，16: 553-561.

7 Kim TJ，Lee YS，Kang JH，et al.Prognostic significance of expression of VEGF and Cox-2 in nasopharyngeal carcinoma and its association with expression of C-erbB2 and EGFR.J Surg Oncol，2011，103: 46-52.

Expression and clinical significance of VEGF，P53，C-erbB2 protein in epithelial ovarian neoplasms

ZHAO Juan，CHEN Weizhi，MA Wei，et al.
Capital Medical University，Beijing Luhe Hospital gynecological，Beijing 101100，China

【Abstract】Objective To investigate the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF)，P53 and human epidermal growth factor receptor 2(C-erbB2 )protein in epithelial ovarian tumors，and to explore their roles in the pathogenesis and development of epithelial ovarian tumors.Methods The expression rates of VEGF，P53 and C-erbB2 protein in 40 cases of normal ovaries，45 cases of benign ovarian tumors，30 cases of borderline ovarian tumors and 65 cases of epithelial ovarian tumors were detected by immunohistochemistry (SP).Results The positive expression rates of VEGF protein were 17.50% (7/40)，24.44% (11/45)，63.33% (19/30)，73.85% (48/65)in normal ovaries，ovarian benign tumors，ovarian borderline tumors，ovarian epithelial tumors，respectively，there were significant differences among them (P＜0.05).The expression levels of VEGF protein were correlated to clinical staging in ovarian cancer group (P＜0.05)，however，which were not related with pathological type and histodifferentiation degree of ovarian cancer (P＞0.05).The positive expression rates of P53 protein were 20.00% (8/40)，24.44% (11/45)，56.67% (17/30)，56.92% (37/65)in normal ovaries，benign ovarian tumors，ovarian borderline tumors，ovarian epithelial tumors，respectrively，however，the positive expression rates of C-erbB2 protein were 15.00% (6/40)，15.56% (7/45)，50.00% (15/30)，67.69% (44/65)in the four kinds of tissues，respectively，there were significant differences among the 4 groups (P＜0.05).The expression levels of C-erbB2 protein were correlated to clinical staging of ovarian cancer(P＜0.05).The expression levels of VEGF were positively correlated to those of P53 and C-cerbB2 in ovarian epithelial tumors (r =0.44，r =0.23，P＜0.05)，which promoted the pathogenesis and development of ovarian cancer together.Conclusion The VEGF，P53 and C-erbB2 play an important role in the pathogenesis and development of ovarian cancer，and P53 and C-erbB2 increase the expression of VEGF in oncogenes，which promote the pathogenesis and development of ovarian cancer together.The combined detection of the three kinds of proteins is valuable in the diagnosis，treatment and prognostic evaluation of ovarian neoplasms.

【Key words】VEGF; P53; C-erbB2; epithelial ovarian tumors; immunohistochemistry

(收稿日期:2014－10－22)

通讯作者:陈隈陟，101100北京市，首都医科大学附属北京潞河医院妇科;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.06.002

【文章编号】1002－7386(2015)06－0808－04

【文献标识码】A

【中图分类号】R 737.31