普洱茶优势菌株赭曲霉的功能和安全性研究

周才碧，陈文品，*，赵振军，穆瑞禄，吴钟玲，张敏星（.华南农业大学园艺学院茶叶科学系，广东广州5064；.长江大学园艺园林学院，湖北荆州4405；.广州质量监督检测研究院，广东广州5064）

普洱茶优势菌株赭曲霉的功能和安全性研究

周才碧1，陈文品1，*，赵振军2，穆瑞禄1，吴钟玲3，张敏星1
（1.华南农业大学园艺学院茶叶科学系，广东广州510642；2.长江大学园艺园林学院，湖北荆州434025；3.广州质量监督检测研究院，广东广州510642）

摘要：为了解赭曲霉在普洱茶渥堆发酵中的功能和安全性，利用普洱茶中分离、鉴定得到的赭曲霉，接种于潮水量35%的云南大叶种晒青毛茶，30℃发酵25 d制备得发酵样，进行感官、理化和安全性分析。结果表明：与对照样相比，发酵样香气浓纯、汤色黑褐、滋味较平和，茶褐素、亮度、红度和黄度等变化较为深刻，且赭曲霉毒素的含量为1.80 μg/kg，低于国内外限量。综上所述，赭曲霉适于普洱茶的渥堆发酵，发酵样的安全性高。

关键词：普洱茶；赭曲霉；分类鉴定；赭曲霉毒素；安全性

普洱茶是云南大叶种晒青毛茶在湿热作用和微生物酶促作用下形成一种特种茶叶，微生物的发酵作用在云南普洱茶品质形成中起决定性的作用，是云南普洱茶品质形成的必要条件[1]，而赭曲霉是普洱茶渥堆发酵优势菌株之一。

卫生品质是决定普洱茶产品能否被安全食用、能否作为商品的基本条件，也是普洱茶产业可持续发展的前提[2]。普洱茶具有降脂[3]、抗氧化[4]、抗过敏[5]、降血糖[6]、抗肿瘤[7]、抗病毒[8]、逆转免疫衰老[9]等功能。但普洱茶的卫生安全性曾遭受多次质疑，特别是普洱茶中多种微生物毒素污染。

微生物毒素具有器官毒性、细胞毒性、分子毒性、遗传毒性和联合毒素，使机体产生免疫机能下降、生长受阻、生产性能减弱、抗病力降低、神经毒性和致癌性等危害[10]，甚至中毒致死，而且一般微生物毒素的化学结构都很稳定，很难去除[11]。

赭曲霉毒素（Ochratoxin，OCT）是由曲霉属[12-13]或青霉产生的有毒代谢产物，包括OCTA、OCTB和OCTC等7种结构类似的化合物，其中以OCTA毒性最大[14]，主要侵害动物肝脏与肾脏，抑制动物细胞有丝分裂，有致畸和致癌作用，IARC将其定为2B类致癌物。常污染粮食、花生、蔬菜、高粱[15]和咖啡豆等农作物[16-18]，以及酵母片[19]。目前，从红茶和普洱茶中尚未检测到曲霉菌株产生的赭曲霉毒素A和伏马毒素[20]，OCTA在50℃温水中易浸出，且表现在植物间相互传递和感染的现象[21]。根据世界卫生组织（WHO）规定，赭曲霉毒素A在谷物中的最高浓度为5 μg/kg；各国标准，规定动物饲料中赭曲霉毒素A的限量范围在100 μg/kg～1000μg/kg之间，食品中的限量范围为1μg/kg～50 μg/kg；中国规定谷物及其制品、豆类及其制品中赭曲霉毒素A的限量不得超过5 μg/kg[22]。

目前，国内外对于普洱茶中赭曲霉的分离、鉴定、功能性及安全性方面的研究少见报道。在普洱茶生产、运输和陈化过程，有曲霉属菌株的参与，普洱茶中存在产生赭曲霉毒素的可能性，因此对普洱茶优势菌株赭曲霉的功能和安全性研究有特别重要的意义。

1　材料与方法

1.1仪器与材料

1.1.1仪器

AB204-N电子分析天平：上海人和科学仪器有限公司；THA-82A台式恒温振荡器：江苏金坛新一佳仪器厂；BCD-206CK冰箱：合肥美菱股份有限公司；SWCJ-2F型双人双面净化工作台：苏州净化设备有限公司；立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司；生化培养箱：宁波江南仪器厂；TP600梯度PCR仪：Takara公司；Qel Doc XR+凝胶成像系统：Bio-rad公司；SHIMADZU-20AT高效液相色谱仪系统，包括二元高压泵、自动进样器、柱温箱：日本岛津公司。

1.1.2材料

陈年普洱茶，即菌株来源的材料统称，包括陈升号2008年的普洱茶熟饼、恒福七子饼2009年的普洱熟茶和宜良祥龙茶厂2009普洱茶熟茶砖；云南大叶种晒青毛茶，即渥堆发酵样的原料，为2013年的春茶（云南临沧）；赭曲霉毒素标准品购于普瑞邦；查氏琼脂培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基，自制。

1.2方法

1.2.1菌株分离和鉴定

1.2.1.1菌株分离和形态鉴定

筛选优质陈年普洱茶，制备10-2～10-7稀释梯度，涂布分离培养菌株，纯化保藏；根据初分菌落的形状、大小、颜色和表面特征等形态特征，结合《中国真菌志》对获得的各菌株进行初步的形态鉴定。

1.2.1.2分子鉴定

首先，采用改良CTAB法提取菌株DNA；其次，使用KOD高保真DNA polymerase进行PCR扩增目的片段，进行3730XL常规测序反应，依照ABI标准程序操作完成全序列基因；最后，在NCBI数据库中进行比对，确定菌株的分类地位，构建进化树。

1.2.2发酵样制备

制备107个/mL上述普洱茶中分离的优势菌株孢子悬浮液，接种于潮水量为35%的云南大叶种晒青毛茶中，在30℃气候箱中培养25 d，取出进行45℃干燥，得到普洱茶发酵样，不加菌株发酵样为对照CK。

1.2.3发酵样检测

1）水浸出物GB/T 8305-2013《茶水浸出物测定》；

2）茶多酚GB/T 8313-2008《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》；

3）氨基酸GB/T 8314-2013《茶游离氨基酸总量的测定》；

4）可溶性糖-蒽酮比色法；

5）茶色素-系统分析法；

6）色差-色差仪；

7）pH-pH仪；

8）赭曲霉毒素NY/T 1650-2008《苹果及山楂制品中展青霉素的测定高效液相色谱法》。

2　结果与讨论

2.1赭曲霉的分离和鉴定

2.1.1形态鉴定

S7在查氏琼脂培养基上菌落生长很快，28℃培养6 d菌落达40 mm～45 mm，菌丝体白色，菌落淡黄色至淡黄褐色，菌落丝绒状，有放射状沟纹，无渗出液，菌落反面淡黄褐色至黄褐色；在显微镜下观察，分生孢子头球形，分生孢梗茎壁粗糙，顶囊半球形，直径20 μm～40 μm，产孢结构双层，梗基（8～12）μm×（2～4）μm，分生孢子球形，直径2.0 μm～3.5 μm。以上培养性状和形态特征符合赭曲霉的标准形态，菌落和孢子形态的图1所示。

2.1.2序列分析

以真菌基因组DNA为模板，利用通用引物扩增获得ITS基因的序列（如PCR图）；利用NCBI中BLAST搜索，得到匹配度较高的已知序列，利用MEGA软件进行多序列比对。结果显示，S7基因序列与已知的Aspergillus ochraceus（GQ408916.1），相似度达到100%，与Aspergillus heteromorphus和Aspergillus nomius的相似度相对较低，系统进化树结果构建如下：

2.2赭曲霉对普洱茶发酵样的影响

2.2.1赭曲霉发酵样的感官品质

微生物对于渥堆发酵型普洱茶的品质影响，具有决定性作用。赭曲霉发酵样的感官品质见图3、表1。

由图3和表1可以看出：与CK相比，赭曲霉发酵样附有棕、褐色菌体，香气浓纯、有特殊的蘑菇香，汤色黑褐色较浑浊，滋味较平和、无刺激性、无特殊的口感。结果表明，赭曲霉菌株107个/mL孢子悬浮液接种于潮水量35%的云南大叶种晒青毛茶中，30℃发酵25 d，菌落生长旺盛，对普洱茶影响较深刻。

2.2.2赭曲霉发酵样的生化成分变化

赭曲霉发酵样的生化成分变化见表2。

由表2可以看出：与CK相比，赭曲霉发酵样水浸出物、茶多酚、可溶性糖含量呈下降趋势，变化幅度分别为7.32%、61.25%、14.53%；氨基酸含量呈上降趋势，变化幅度为40%。茶红素、亮度呈下降趋势，变化幅度为62.7%、262.86%；而茶褐素、红度和黄度呈上升趋势，变化幅度为623.3%、530.35%和235.57%；pH变化不明显。

2.2.3赭曲霉发酵样的安全性

利用HPLC测定赭曲霉发酵样中展青霉素的含量，由表2知，赭曲霉毒素的含量为1.80 μg/kg（低于国内外限量5 μg/kg）。结果表明，赭曲霉在潮水量35%云南大叶种晒青毛茶中，30℃发酵25 d，发酵样赭曲霉毒素低于国内外限量，安全性高。

3　结论

赭曲霉在查氏琼脂培养基上菌落生长很快，28℃培养6 d菌落达40 mm～45 mm，菌丝体白色，菌落淡黄色至淡黄褐色，菌落丝绒状，有放射状沟纹，无渗出液，菌落反面淡黄褐色至黄褐色；赭曲霉在潮水量35%云南大叶种晒青毛茶中，30℃发酵25 d，发酵样附有棕、褐色菌体，香气浓纯、有特殊的蘑菇香，汤色黑褐色较浑浊，滋味较平和，无刺激性、无特殊的口感，茶褐素、亮度、红度和黄度等变化较为深刻，且赭曲霉毒素低于国内外限量，安全性高，适于普洱茶的渥堆发酵。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.042

收稿日期：2014-10-15

基金项目：国家自然科学基金项目（31270725）

作者简介：周才碧（1986—），男（布依），研究生，研究方向：茶叶加工与安全。

*通信作者：陈文品（1971—），男，副教授，硕士生导师，研究方向：茶叶加工与安全。

Research on Function and Safety of Aspergillus ochraceus，A Preponderant Fungus during the Fermentative Process of Pu'er tea

ZHOU Cai-bi1，CHEN Wen-pin1，*，ZHAO Zhen-jun2，MU Rui-lu1，WU Zhong-ling3，ZHANG Min-xing1
（1.Department of Tea Science，College of Horticulture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，Guangdong，China；2.College of Horticulture and Landscape Architecture，Yangtze University，Jingzhou 434025，Hubei，China；3.Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute，Guangzhou 510642，Guangdong，China）

Abstract：In order to understand the Function and Safety of Aspergillus ochraceus during the Fermentative Process of Pu'er tea，Aspergillus ochraceus separated from the Pu'er tea，was inoculated on the sun-dried green tea with 35%water，cultured 25 days with 30℃，then evaluated the sensory，security，physical and chemical of fermented sample.The research results showed that compared with CK，the contents of theabrownins，lightness，redness and brightness was changed significantly in the fermented sample with sweet thick aroma accompanied special mushroomy flavor，dark turbid liquor in chocolate-brown color，gentle taste without thrill or special，and the contents of ochratoxin was 1.80 μg/kg under the limition of home and abroad.In conclusion，Aspergillus ochraceus is one of preponderant fungus during the fermentative process of Pu'er tea，and plays a very important role to the formation of Pu'er tea quality with high safety.

Key words：Pu'er tea；Aspergillus ochraceus；identification；ochratoxin；safety