FAT/CD36在高脂喂养小鼠脂肪组织炎症中的作用*

张艳艳， 赵 蕾， 谢云霞， 陈压西， 阮雄中

(重庆医科大学脂糖代谢性疾病重庆市重点实验室，脂质研究中心，重庆 400016)



FAT/CD36在高脂喂养小鼠脂肪组织炎症中的作用*

张艳艳， 赵 蕾△， 谢云霞， 陈压西， 阮雄中

(重庆医科大学脂糖代谢性疾病重庆市重点实验室，脂质研究中心，重庆 400016)

目的： 探讨脂肪酸转运酶/白细胞分化抗原36 (fatty acid translocase/CD36，FAT/CD36)在高脂饮食诱导的小鼠脂肪组织炎症中的作用。方法: 将6周龄雄性C57BL/6J小鼠分别随机分为普通饮食组和高脂饮食组，喂养14周后，ELISA测定血清游离脂肪酸(FFA)含量，应用荧光实时定量 PCR和Western blotting检测脂肪组织中FAT/CD36及炎症/趋化因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1、MIP-1)mRNA和蛋白的表达，免疫组织化学染色检测脂肪组织巨噬细胞浸润，比较高脂喂养14周的野生型小鼠和CD36基因敲除小鼠的脂肪组织炎症反应情况。结果: 与普通饮食组相比，高脂饮食能增强C57BL/6J小鼠脂肪组织的FAT/CD36及炎症/趋化因子的表达，促进巨噬细胞在脂肪组织的浸润。与高脂饮食喂养的野生型小鼠相比，CD36 基因敲除小鼠的脂肪组织炎症因子、趋化因子表达明显降低，脂肪组织巨噬细胞浸润减少。结论: 高脂饮食通过上调脂肪组织FAT/CD36的表达激活了脂肪组织炎症。

脂肪酸转运酶/白细胞分化抗原36； 高脂饮食； 脂肪组织； 炎症

随着人民生活水平的提高及运动量的减少，肥胖、糖尿病、脂肪肝、高血压、血脂异常等代谢性疾病已成为严重影响我国人民健康的多发病及常见病。近期的研究表明炎症反应是肥胖及其相关代谢性疾病发生发展的核心环节[1]。2006年Hotamisligil[2]首次提出“代谢性炎症”的概念，主要指由营养物和代谢产物所触发、多种细胞和细胞因子共同参与的全身性、系统性的低峰度炎症。

脂肪酸转运酶/白细胞分化抗原36(fatty acid translocase/CD36, FAT/CD36)是一个88 kD的膜糖蛋白，属于B 类清道夫受体家族，广泛表达于多种细胞(肌细胞、单核细胞、巨噬细胞和肝细胞等)，尤其在脂肪细胞中高表达[3]。FAT/CD36不仅能直接介导脂肪酸的摄取和转运，还能识别众多致炎性的内源性代谢产物，如氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)、非修饰的脂蛋白和淀粉样蛋白等，被认为是将机体的代谢和炎症这两大过程有机联合在一起的重要“桥梁”[4]。既往研究表明脂肪组织是代谢性炎症产生的主要场所[3-5]。然而，FAT/CD36在脂肪组织代谢性炎症中的作用目前国内尚未见相关报道。因此本研究拟应用C57BL/6J小鼠、野生型(widetype，WT)/CD36基因敲除(CD36 knockout，CD36 KO)小鼠作为动物模型，观察高脂饮食对脂肪组织FAT/CD36表达和炎症反应的影响，并初步探讨CD36基因缺失对高脂喂养小鼠的脂肪组织炎症的作用。

材 料 和 方 法

1 动物

WT、CD36 KO小鼠由美国Maria Febbraio教授惠赠，C57BL/6J小鼠购自重庆医科大学动物中心。

2 主要试剂

普通饲料(normal chow diet，NCD)和高脂饲料购自Research Diets；Trizol RNA提取试剂、逆转录试剂盒和SYBR Green PCR Master Mix均购自TaKaRa；细胞总蛋白提取试剂盒购自凯基公司；免疫组化检测试剂盒购自北京中杉金桥公司；游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)测定试剂盒购自浙江东瓯公司；CD36、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)Ⅰ抗购自Santa Cruz；白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)抗体购自Millipore；单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白-1 (macrophage inflammatory protein-1，MIP-1)抗体购自上海生工生物工程公司；β-肌动蛋白 (β-actin)Ⅰ抗和Ⅱ抗购自北京中杉金桥公司；F4/80 Ⅰ抗购自Biolegend；硝酸纤维膜和化学发光试剂购自GE。

3 主要方法

3.1 动物选择与分组 将6 周龄的雄性C57BL/6J小鼠随机分为普通饮食(NCD)组和高脂饮食(high-fat diet，HFD)组，喂养14周。并分别选取8只6 周龄的雄性WT和CD36 KO小鼠，给予高脂喂养14周。

3.2 Real-time PCR检测相关基因mRNA的表达 Trizol提取细胞总RNA。将1 μg总RNA逆转录成cDNA，逆转录条件为：42 ℃ 60 min，99 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min，保存于-20 ℃。再取2 μL逆转录产物进行real-time PCR，以β-actin为内参照，反应体系为25 μL。扩增条件： 95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共40个循环。引物序列见表1。

3.3 Western blotting检测相关蛋白的表达 试剂盒提取细胞蛋白，SDS-PAGE分离蛋白样品，转膜。室温封闭1 h后，将膜用 I 抗(CD36、TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、MIP-1和β-actin)室温下孵育2 h，然后用辣根过氧化物酶标记的 II 抗室温下孵育1 h。最后用化学发光试剂盒检测信号，并用Quantity One软件对条带的强度(亮度×面积)进行定量。

3.4 免疫组织学染色 按照试剂盒说明书，采用2步法检测脂肪组织内F4/80蛋白表达，DAB显色。I抗浓度1∶ 200。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

3.5 酶联免疫吸附实验(ELISA) 按照试剂盒说明书，检测血清中FFA含量。

4 统计学处理

用SPSS 17.0软件进行统计分析，数据均以均数±标准误(mean±SEM)表示。采用t-test对两样本进行比较检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 高脂饮食能促进C57BL/6J小鼠的高脂肪酸血症和脂肪组织CD36表达

不同饮食喂养C57BL/6J小鼠14周，收集动物血清和脂肪组织样本，用ELISA检测小鼠血清FFA，用real-time PCR检测CD36 mRNA表达，Western blotting及免疫组织化学检测C57BL/6J小鼠脂肪组织CD36蛋白的表达。如图1所示，与普通饮食组相比，高脂饮食可以使小鼠血清的FFA明显增加，使脂肪组织内的CD36 mRNA约升高了3.23±0.64倍，CD36蛋白表达约升高了0.49±0.10倍差异有统计学意义(P<0.05)。

2 高脂饮食能促进C57BL/6J小鼠脂肪组织的炎症反应

与普通饮食组相比，高脂饮食可使C57BL/6J小鼠脂肪组织内炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6的 mRNA分别约升高0.78±0.46、1.69±0.65、0.94±0.52倍(P<0.05)；趋化因子MCP-1和 MIP-1 mRNA分别约升高0.89±0.20、1.94±0.38倍(P<0.05)；C57BL/6J小鼠脂肪组织炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、趋化因子MCP-1、MIP-1的蛋白表达也呈明显升高趋势(P<0.05)，同时巨噬细胞浸润显著增加(巨噬细胞标记物F4/80染成黄色，箭头指示处)，见图2。

Figure 1.HFD upregulated CD36 expression in the adipose tissues of C57BL/6J mice. Mean±SEM. n=8. #P<0.05 vs NCD.

3CD36基因敲除可以减弱高脂诱导的脂肪组织炎症反应

高脂喂养CD36 KO小鼠和WT小鼠14周后收集脂肪组织并做相应检测。我们发现CD36 KO小鼠的脂肪组织炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6的 mRNA含量分别为WT小鼠的56.0%±12.0%、35.0%±9.7%和27.0%±5.1%(P<0.05)；趋化因子MCP-1和 MIP-1的 mRNA表达为对照小鼠的59%±15%和43%±12%(P<0.05)；同时CD36 KO小鼠脂肪组织炎症/趋化因子TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1和MIP-1的蛋白表达也明显降低(P<0.05)，巨噬细胞浸润显著减少(巨噬细胞标记物F4/80染成黄色细胞较少)，见图3。

Figure 3.The expression of cytokine and chemokine in the adipose tissues of WT and CD36 KO mice. Mean±SEM. n=8. #P<0.05 vs WT mice.

讨 论

目前学界关于肥胖、2型糖尿病、动脉粥样硬化、脂代谢紊乱、高血压等代谢性疾病的发病机制的研究报道很多，代谢性炎症在其发生中的核心作用也越来越得到公认[6]，但是代谢性炎症发生的具体分子机制目前尚未阐明。

既往研究提示，脂肪酸转运蛋白FAT/CD36可能是细胞炎症反应的一个关键蛋白[7]。在对动脉粥样硬化和阿尔茨海默氏病的研究中发现，当CD36蛋白与其配体ox-LDL结合后，能募集TLR4/6受体形成CD36/TLRs多聚体，并诱导TLR4/6磷酸化，进而激活NF-kappaB通路，释放氧化应激产物，促进巨噬细胞迁移，触发炎症反应[8]。

在本研究中，我们发现高脂喂养的C57BL/6J小鼠血清中的FFA含量增高，且脂肪组织CD36的mRNA和蛋白表达较普通饮食组均明显增加，同时伴有脂肪组织炎症因子/趋化因子表达水平及炎症细胞浸润的显著增加。推测高脂条件下，小鼠血清中CD36的配体(如游离脂肪酸)含量增加，进而上调脂肪组织的CD36表达；CD36通路活化后可以激活NF-κB通路，产生并分泌大量的炎症因子和趋化因子，从循环中募集巨噬细胞，促使大量巨噬细胞浸润到脂肪组织中，活化的巨噬细胞又可以进一步产生和释放炎症/趋化因子，放大炎症反应，最终导致脂肪组织代谢性炎症的发生。病理状态下，脂肪组织所产生和分泌的多种炎症/趋化因子，可以通过自分泌、旁分泌和内分泌网状信号旁路作用于脂肪组织局部和胰岛、肌肉、肝脏等全身多种细胞，从而导致了胰岛素抵抗等代谢性疾病的发生[9]。

为进一步确证脂肪酸转运蛋白FAT/CD36是否在这一高脂饮食诱导的脂肪组织炎症反应中扮演了重要角色，我们比较了WT和CD36 KO小鼠在高脂喂养条件下的炎症情况。结果表明：CD36 KO小鼠脂肪组织中的炎症反应较WT小鼠显著降低，从而提示高脂诱导的小鼠脂肪组织代谢性炎症的产生依赖于脂肪酸转运蛋白FAT/CD36通路。

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Role of FAT/CD36 in high-fat diet-induced adipose tissue inflammation

ZHANG Yan-yan, ZHAO Lei, XIE Yun-xia, CHEN Ya-xi, RUAN Xiong-zhong

(CentreforLipidResearch,ChongqingKeyLaboratoryofLipidandGlucoseMetabolism,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:laleinlz@hotmail.com)

AIM: To investigate the role of fatty acid translocase/CD36 (FAT/CD36) in adipose tissue inflammation induced by a high-fat diet. METHODS: C57BL/6J mice were fed with a normal-chow diet (NCD) or a high-fat diet (HFD) for 14 weeks. The content of free fatty acid (FFA) in the serum was measured by ELISA. The expression of CD36, cytokines and chemokines at mRNA and protein levels in the adipose tissues was determined by real-time polymerase chain reaction and Western blotting. Immunohistochemical staining was used to examine the macrophages infiltration in the adipose tissues. The inflammatory responses inCD36 knockout mice and wild type mice with high-fat diet were analyzed. RESULTS: The levels of FAT/CD36 were higher in HFD group than that in NCD group. HFD feeding enhanced the mRNA and protein expression of IL-1β, IL-6, TNF-α, MCP-1 and MIP-1, as well as promoted macrophage infiltration in the adipose tissues. Interestingly, as fed with HFD, the expression of cytokines/chemokines and macrophage infiltration were significantly reduced in adipose tissues of theCD36 knockout mice, compared with the wild type mice. CONCLUSION: High-fat diet promotes adipose tissue inflammation in the mice in a FAT/CD36-dependent manner.

Fatty acid translocase/CD36; High-fat diet; Adipose tissues; inflammation

1000- 4718(2015)03- 0463- 05

2014- 09- 29

2014- 12- 09

国家自然科学基金资助项目(No. 81270493； No. 81200567)

△通讯作者 Tel： 023-68486780; E-mail: laleinlz@hotmail.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.014