生芪、连翘对中华绒螯蟹生长及健康指标的影响

孙学亮　孙朦朦　季延斌　等

摘要：使用生芪、连翘与普通河蟹饲料混合制成中草药饲料，分组饲喂，分别在试验开始后第2周、第4周取样，测定试验组血清中与机体非特异免疫相关的重要酶类活性指标的免疫保护率。结果表明，在饲料中添加生芪、连翘均对河蟹体内的健康指标产生了影响，生芪、连翘对SOD、CAT活力表现为促进作用，同时NO、MDA含量降低，所有单方10%浓度效果均优于0.5%浓度，说明使用效果随着单方浓度的增加而增强。

关键词：中华绒螯蟹；生芪；连翘

中图分类号： S917.4；S963.73+6文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0224-03

收稿日期：2014-02-24

基金项目：国家星火计划（编号：2013GA610002）；天津市高等学校科技发展基金（编号：20110621）；天津市农业科技成果转化与推广项目（编号：201101050）。

作者简介：孙学亮（1984—），男，硕士，从事水产养殖研究。E-mail：sunxueliang1234@aliyun.com.cn。

通信作者：陈成勋，从事水产养殖研究。E-mail：ccnxny@163.com。河蟹学名中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis H.Milne-Edward），别称河蟹、毛蟹、湖蟹、螃蟹、大闸蟹、清水蟹等，隶属于节肢动物门（Arthropoda）甲壳纲（Crustacea）软甲亚纲（Malacostraca）十足目（Decapoda）爬行亚目（Reptantia）方蟹科（Grapsidae）绒螯蟹属（Eriochier）[1]。河蟹具有生长速度快、肉质细嫩、味道鲜美、经济价值高等优点，近年来，我国河蟹养殖业发展迅速，河蟹养殖业已成为我国的特色产业[2]。我国有5 000多种中药资源可供开发利用。中草药大多含有丰富的蛋白质、纤维素、微量元素、矿物质、未知生长因子及各类生物活性物质，具有增进机体新陈代谢、促进蛋白质及酶的合成、增强水产动物免疫功能等作用[3]。中草药作为混饲剂或饲料添加剂能够满足当前水产养殖业集约化、规模化生产的需要，应用中草药防治水产动物疾病完全符合发展无公害水产业、生产绿色水产品的病害防治准则[4-5]。本试验使用生芪、连翘与普通河蟹饲料混合制成中草药饲料，分组饲喂，测定试验组血清中与机体非特异免疫相关的重要酶类活性指标的免疫保护率，探讨中草药添加剂对于提高河蟹非特异免疫力的效果，旨在为推广中草药免疫增强剂提供理论指导。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验饲料202型河蟹专用商品饲料（浙江欣欣饲料股份有限公司嘉兴大桥分公司）粗蛋白质含量≥34.0%，粗脂肪含量≥3.0%，钙含量1.0%～3.0%，总磷含量≥1.0%，将其粉碎后过80目筛，取细粉备用。将中草药生芪、连翘（均购于安徽新兴中药饮片有限公司）用高速药材调料粉碎机粉碎后过80目筛，取细粉备用。将3种中草药的细粉分别按0.5%、1.0%2个浓度梯度采用逐级混匀方法均匀混入上述已粉碎好的商品饲料中，制型后备用。

1.1.2试验用蟹试验用幼蟹取自天津市宁河县七里海河蟹种业基地，平均体质量为（0.35±0.02） g。

1.2方法

1.2.1试验设计及日常管理河蟹在箱内暂养，投喂未添加中药的饲料，箱中放入石块提供攀爬与躲避场所。驯化7～10 d后，待河蟹摄食正常后开始试验。试验按投喂饲料中含中草药种类、剂量不同分为对照组、生芪组（Ⅰ0.5、Ⅰ1.0）、连翘组（Ⅱ0.5、Ⅱ1.0），每组设2个平行，每箱100只河蟹。试验期间每天投喂试验饵料2次，每次投喂量为河蟹体质量的3%～5%，08：30投喂量占每天总投喂量的40%～50%，16：30 投喂量占每天总投喂量的50%～60%，视河蟹吃食情况适当增减，及时清除残留的饲料、幼蟹蜕皮物及死亡的幼蟹。每天15：00换1次曝气1 d的自来水，每次换水量为箱中水量的1/3～1/2（视水质情况而定），养殖过程中保持连续充气，水温控制在24～28 ℃。试验期内不施用任何药物，保证试验结果不发生偏差。试验周期为30 d，分别在试验期内第2周、第4周进行采样，采样时每箱随机抽取30只河蟹。

1.2.2样品制备由于幼蟹个体小，去外壳易黏连内脏组织，对数据产生影响，幼蟹外壳主要成分是CaCO3，所以将蟹体整体磨碎制作组织匀浆。将蟹用蒸馏水漂洗2次，捞出并滤干，放在0 ℃含冰水的解剖盘内，逐个沿基部剪去蟹体所有步足，放入封口袋中并标记，贮存于-20 ℃冰箱中，进行组织匀浆之前，取蟹体在冷生理盐水中漂洗，滤纸拭干，称质量，均匀平铺在冰浴的5 mL小烧杯内，蟹体之间尽量不堆叠。用移液管量取0.86%冷生理盐水。先向烧杯中加入可以淹没小蟹的生理盐水量，再用干净已消毒的眼科小剪尽快剪碎组织块，最后用余下的生理盐水分2次冲洗剪刀，以保证剪刀上无残留。将组织移入 1 mL Eppendorf管中，标号，用SCIENTZ-192高通量组织研磨器充分匀浆，制成10%组织匀浆，取适量组织匀浆制作涂片（直接涂片、染色均可以），显微镜下观察细胞是否磨破，若没有破则可延长匀浆时间或增加冻溶次数（此步可省略）。用5840R高速冷冻离心机15 000 r/min 4 ℃离心30 min，吸取上清液置于1 mL Eppendorf管中，标号。将所得上清液在同样的条件下再离心1次，吸出上清液置于 1 mL Eppendorf管中，根据试验需要，取适量上清液进行测定，并于24 h内分析完毕。

1.3抗氧化指标的测定

试验中各组织总超氧化物歧化酶（T-SOD）含量、过氧化氢酶（CAT）含量、丙二醛（MDA）含量、NO含量等指标均采用南京建成生物工程技术研究所提供的试剂盒测定。

1.4数据处理

采用“平均值±标准误”表示数据，采用SPSS 18.0软件中的单因素方差分析数据。

2结果与分析

2.1生芪对河蟹体内超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响

由表1可知，第2周Ⅰ1.0组与Ⅰ0.5组河蟹体内SOD活性差异不显著，Ⅰ0.5组河蟹体内SOD活性与对照组相比差异不显著，Ⅰ1.0组河蟹体内SOD活性显著高于对照组（P<0.05）。第4周3组之间河蟹体内SOD活性均无显著差异，Ⅰ1.0组活性最大，对照组活力最小。

表1生芪对河蟹体内SOD活性的影响

处理SOD活性（U/mg）第2周第4周对照组86.49±1.75b103.19±1.75aⅠ0.5组94.74±3.32ab108.44±3.42aⅠ1.0组98.67±2.77a110.02±1.52a注：同列数据后不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。表2至表8同。

2.2连翘对河蟹体内超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响

由表2可知，第2周Ⅱ0.5组河蟹体内SOD活性与对照组相比差异显著（P<0.05），Ⅱ1.0组与对照组差异不显著，Ⅱ0.5组与Ⅱ1.0组差异不显著。Ⅱ1.0组SOD活性最大，Ⅱ0.5组次之，对照组最小。第4周Ⅱ1.0组河蟹体内SOD活性与对照差异不显著，Ⅱ0.5组与对照差异显著（P<0.05），Ⅱ0.5组与Ⅱ1.0组差异不显著，Ⅱ1.0组活性最大，对照组最小。

表2连翘对河蟹SOD活性的影响

处理SOD活性（U/mg）第2周第4周对照组86.49±1.75b103.19±1.75bⅡ0.5组93.42±8.53a108.11±8.44aⅡ1.0组99.33±6.36ab113.06±6.27ab

2.3生芪对河蟹体内过氧化氢酶（CAT） 活性的影响

由表3可知，第2周Ⅰ0.5组、Ⅰ1.0组河蟹体内CAT活性均显著高于对照组（P<0.05），Ⅰ0.5组与Ⅰ1.0组差异不显著（P>0.05）。Ⅰ1.0组河蟹体内CAT活性最大，Ⅰ0.5组次之，对照组最小。第4周Ⅰ0.5组、Ⅰ1.0组河蟹体内CAT活性均显著高于对照组（P<0.05），Ⅰ0.5组与Ⅰ1.0组无显著差异（P>005）。Ⅰ1.0组河蟹体内CAT活性最大，Ⅰ0.5组次之，对照组最小。

2.4连翘对河蟹体内过氧化氢酶（CAT） 活性的影响

由表4可知，第2周Ⅱ0.5组、Ⅱ1.0组河蟹体内CAT活性均显著高于对照组（P<0.05），Ⅱ0.5组与Ⅱ1.0组差异不显著

表3生芪对河蟹体内CAT活性的影响

处理CAT活性（U/mg）第2周第4周对照组10.11±0.19b12.45±0.18bⅠ0.5组10.58±0.07a12.97±0.04aⅠ1.0组10.62±0.13a13.04±0.27a

（P>0.05）。Ⅱ0.5组河蟹体内CAT活性最大，Ⅱ0.5组次之，对照组最低。第4周Ⅱ0.5组、Ⅱ1.0组河蟹体内CAT活性均显著高于对照组（P<0.05），Ⅱ0.5组与Ⅱ1.0组无显著差异（P>0.05）。Ⅱ1.0组河蟹体内CAT活性最大，Ⅱ0.5组次之，对照组最低。

表4连翘对河蟹体内CAT活力的影响

处理CAT活性（U/mg）第2周第4周对照组10.11±0.19b12.45±0.19bⅡ0.5组10.57±0.06a13.02±0.09aⅡ1.0组10.66±0.15a13.11±0.35a

2.5生芪对河蟹体内丙二醛（MDA）含量的影响

由表5可知，第2周Ⅰ0.5组河蟹体内MDA含量显著低于对照组及Ⅰ1.0组（P<0.05），对照组与Ⅰ1.0组之间无显著差异（P>0.05）。第4周Ⅰ0.5组河蟹体内MDA含量显著低于对照组、Ⅰ1.0组（P<0.05），对照组与Ⅰ1.0组无显著差异（P>0.05）。对照组MDA含量最高，Ⅰ0.5组最低。

表5生芪对河蟹体内MDA含量的影响

处理MDA含量（nmol/mg）第2周第4周对照组2.26±0.08b1.55±0.06bⅠ0.5组2.02±0.06a1.35±0.09aⅠ1.0组2.21±0.10b1.52±0.13b

2.6连翘对河蟹体内丙二醛（MDA）含量的影响

由表6可知，第2周Ⅱ0.5组河蟹体内MDA含量显著低于对照组、Ⅱ1.0组（P<0.05），对照组与Ⅱ1.0组之间无显著差异（P>0.05）。对照组河蟹体内MDA含量最高，Ⅱ0.5组最低。第4周Ⅱ1.0组河蟹体内MDA含量显著高于对照组、Ⅱ0.5组（P<0.05），对照组与Ⅱ0.5组无显著差异（P>0.05）。Ⅱ1.0组河蟹体内MDA含量最高，Ⅱ0.5组最低。

表6连翘对河蟹体内MDA含量的影响

处理MDA含量（nmol/mg）第2周第4周对照组2.26±0.08b1.55±0.06aⅡ0.5组2.15±0.07a1.53±0.06aⅡ1.0组2.24±0.11b1.78±0.10b

2.7生芪对河蟹体内一氧化氮（NO）含量的影响

由表7可知，第2周Ⅰ0.5组、Ⅰ1.0组河蟹体内NO含量均显著低于对照组（P<0.05），Ⅰ1.0组河蟹体内NO含量虽低于Ⅰ0.5组，但是二者间无显著差异（P>0.05）。对照组河蟹体内NO含量最高，Ⅰ0.5组次之，Ⅰ1.0组最低。第4周Ⅰ0.5组与Ⅰ1.0组河蟹体内NO含量显著低于对照组（P<0.05），Ⅰ1.0组河蟹体内NO含量虽低于Ⅰ0.5组，但是二者间无显著差异（P>0.05）。对照组NO含量最高，Ⅰ0.5组次之，Ⅰ1.0组最低。

表7生芪对河蟹体内NO含量的影响

处理NO含量（μmol/L）第2周第4周对照组6.97±0.35b9.70±0.29bⅠ0.5组3.51±0.60a4.79±0.50aⅠ1.0组2.62±0.32a4.33±0.20a

2.8连翘对河蟹体内一氧化氮（NO）含量的影响

由表8可知，第2周Ⅱ0.5组河蟹体内NO含量与对照组、Ⅱ1.0组差异不显著（P>0.05），Ⅱ1.0组NO含量显著低于对照组（P<0.05），对照组NO含量最大，Ⅱ0.5组次之，Ⅱ1.0组最小。第4周Ⅱ1.0组河蟹体内的NO含量与Ⅱ0.5组差异不显著（P>0.05），Ⅱ0.5组NO含量显著低于对照组（P<0.05），对照组NO含量最大，Ⅱ0.5组次之，Ⅱ1.0组最低。

表8连翘对河蟹体内NO含量的影响

处理NO含量（μmol/L）第2周第4周对照组6.97±0.35b9.70±0.29bⅡ0.5组5.55±0.46ab7.83±0.30aⅡ1.0组4.62±0.18a7.05±0.20a

3结论与讨论

3.1生芪、连翘对河蟹体内超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响

SOD具有抗菌、抗病毒等作用，可作为机体非特异性免疫指标来评判免疫刺激剂对机体非特异性免疫力的影响[4-8]。过氧化氢酶是一种酶类清除剂，是以铁卟啉为辅基的结合酶。它可清除机体内的过氧化氢，使细胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。本研究表明，生芪、连翘对中华绒螯蟹体内超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢酶活性（CAT）有促进作用，且与添加剂量、作用时间有关。李明等研究认为，中草药（黄芪、板蓝根、金银花、生石膏）对凡纳滨对虾血清中SOD活性有显著影响[9]。李廷友等研究认为，在饲料中添加一定比例的枸杞、黄芪、茯苓等中药能大幅提高中华绒螯蟹、扣蟹体内SOD活性[10]。杨柳认为，一定剂量的贯叶连翘能明显延长小鼠常压耐缺氧时间、增加SOD活力、CAT活力[11] 。

3.2生芪与连翘对河蟹体内丙二醛（MDA）含量的影响

MDA含量能比较准确地反映机体内自由基的代谢情况及组织的氧化损伤情况，这对判断机体的健康状况以及免疫防御能力具有重要价值[12]。本研究表明，投喂生芪4周后，Ⅰ0.5组、Ⅰ1.0组河蟹体内丙二醛（MDA）含量均较对照组有所降低。陈会良等在肉鸡饲料中添加中草药添加剂，发现鸡肉中MDA含量随之降低[13]。陈雁南等认为，在肉鸡饲料中添加中草药添加剂能有效提高肉鸡抗氧化水平[14]。与公衍玲等用中药提取物体外抗氧化活性研究得出的结论[15]相同。

3.3生芪与连翘对河蟹体内一氧化氮（NO）含量的影响

NO起着信使分子的作用，也能在神经系统的细胞中发挥作用。免疫系统中，巨噬细胞产生的NO分子不仅能抗击侵入人体的细菌、病毒等微生物，而且还能够在一定程度上阻止癌细胞繁殖，阻止肿瘤细胞扩散等[16-17]。本研究表明，投喂生芪4周后，Ⅰ0.5组、Ⅰ1.0组河蟹体内NO含量均显著低于对照组，说明生芪能降低河蟹体内NO含量。这与韩永禧等[18]、杨长春等[19]的研究结果一致。在饲料中添加生芪、连翘均对河蟹体内的健康指标产生了影响，生芪、连翘对SOD、CAT活力表现为促进作用。本试验中所有单方1.0%浓度效果均优于0.5%浓度，说明使用效果随着单方浓度的增加而增强。

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