类胰蛋白酶通过激活PAR-2促进肠黏膜上皮IEC-6细胞损伤*

李 顺， 黄品婕， 葛 缅， 甘小亮

(1中山大学附属第三医院麻醉科，广东 广州 510630； 2中山大学中山眼科中心麻醉科，广东 广州 510060)



类胰蛋白酶通过激活PAR-2促进肠黏膜上皮IEC-6细胞损伤*

李 顺1， 黄品婕1， 葛 缅1， 甘小亮2△

(1中山大学附属第三医院麻醉科，广东 广州 510630；2中山大学中山眼科中心麻醉科，广东 广州 510060)

目的： 观察类胰蛋白酶(tryptase)对小肠黏膜上皮细胞IEC-6的作用及机制。方法: 体外培养IEC-6细胞，随机分为对照(control)组、tryptase处理组、蛋白酶激活受体 2(PAR-2)抑制剂(FSLLRY-NH2，FS)处理组以及tryptase+FS处理组。采用MTT法检测细胞生存率；测定分泌的乳酸脱氢酶(LDH)活性；Western blotting 测定PAR-2和cleaved-caspase 3的表达。结果: 与对照组比，100 μg/L和1 000 μg/L 类胰蛋白酶导致细胞生存率明显降低(P<0.05)。与对照组相比，10 μg/L到1 000 μg/L类胰蛋白酶导致LDH的活性明显增加(P<0.05)。与对照组相比，100 μg/L和1 000 μg/L 类胰蛋白酶导致细胞的PAR-2及cleaved-caspase 3表达明显升高(P<0.05)。与1 000 μg/L tryptase处理组比较，FS能够明显增加细胞生存率、降低LDH活性及cleaved-caspase 3表达(P<0.05)。 结论: 类胰蛋白酶通过激活PAR-2促进IEC-6细胞损伤，且这种损伤呈浓度依赖性。

类胰蛋白酶； 蛋白酶激活受体2； IEC-6细胞； 乳酸脱氢酶； Caspase 3

我们在既往研究中发现肥大细胞激活释放炎性介质加重了小肠缺血-再灌注损伤进程[1]。在众多释放的炎性介质中，类胰蛋白酶约占1/4～1/2[2]，具有广泛的生物活性，如导致高血压病心肌纤维化[3]和星形胶质细胞活化[4]等。

蛋白酶激活受体2(protease activated receptor-2, PAR-2)作为一种G蛋白偶联膜受体，广泛分布在胃肠道等脏器和组织中。同时，我们前期在动物模型中发现抑制类胰蛋白酶能够减轻小肠黏膜损伤，且类胰蛋白酶的变化与PAR-2的变化趋势一致[5]。前期研究结果提示类胰蛋白酶可能通过PAR-2途径导致小肠黏膜损伤，为了证实上述设想，本研究拟在体外细胞实验中，通过直接阻断PAR-2来观察类胰蛋白酶对大鼠小肠上皮细胞系IEC-6的作用。

材 料 和 方 法

1 细胞

IEC-6细胞系购于北京协和细胞库。IEC-6细胞用含4.5 g/L高糖DMEM培养液、体积分数5% FBS、10mg/L胰岛素的混合培养液于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养，24～50代的细胞用于本次实验。

2 材料与试剂

DMEM-H、胎牛血清和0.25%胰酶(Gibco)；类胰蛋白酶(Promega)；PAR-2抑制剂FSLLRY-NH2(FS， Sigma)；MTT试剂盒和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)检测试剂盒和DMSO溶剂(KeyGEN)；PAR-2单克隆抗体(Santa Cruz)；Total-caspase 3、 cleaved-caspase 3单克隆抗体(CST)。

3 主要方法

3.1 实验分组 实验分为对照(control)组、tryptase处理组、PAR-2抑制剂FS处理组以及tryptase+FS处理组。对照组用含1% FBS的高糖DMEM培养。tryptase处理组分为4个终浓度组：1 μg/L、10 μg/L、100 μg/L及1 000 μg/L；FS处理组给予FS使终浓度为400 μmol/L。实验重复3～4次。

3.2 MTT细胞增殖及细胞毒性检测 IEC-6细胞用1 mL 0.25%胰酶消化后以每孔5 000个的密度接种于96孔板，在37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养24 h，待细胞密度增至90%(约2.5×104/well)时，再予以相应的药物处理(培养液中含1% FBS)，每孔培养液体积为100 μL。每组复设4孔，每孔加入1×MTT (0.5 g/L) 试剂，在37 ℃孵育4 h；吸出上清，每孔加入150 μL DMSO，用平板摇床摇匀10 min; 设置本底孔(完全培养基加MTT，无细胞)，采用酶标仪490 nm波长测定各孔吸光度(A)值。细胞存活率=(A实验孔-A本底孔)/(A对照孔-A本底孔)×100%。

3.3 LDH活性检测 IEC-6细胞用1 mL 0.25%胰酶消化后以每孔10 000个密度接种于96孔板，在37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养24 h，待细胞密度增至90%(约5×104/well)，PBS洗板2次后再予以相应的药物处理(培养液中含1% FBS)；收集上清，在4 ℃、12 000 ×g的条件下离心15 min，每个样本取50 μL用于后续检测。依据LDH检测试剂盒操作说明，设置标准管、标准空白管、测定管和对照管后逐步进行，最后于440 nm处测各检测孔A值。

LDH活性(U/L)=(测定管A值-对照管A值)/(标准管A值-空白管A值)×标准品浓度(2 mmol/L)×样品稀释倍数×1 000。

3.4 Western blotting检测PAR-2及cleaved-caspase 3的蛋白水平 IEC-6细胞使用胰酶消化后以每板4×105个的密度接种于6孔板，常规培养24 h，待细胞密度增至90%(约每板2×106个)后进行相应的药物处理(处理组含1% FBS)。将培养板置于冰上，用冷PBS洗涤3遍，用全蛋白提取液刮取，超声裂解后于12 000 ×g4 ℃ 离心15 min，取上清，进行BCA蛋白定量后变性、上样，分别采用10%和15% SDS-PAGE分离蛋白(200 V，45 min)。转膜使用PVDF膜(100 V，60 min)。5%脱脂牛奶室温封闭1 h，分别加入抗PAR-2的I抗(1∶500)和cleaved-caspase 3 、caspase 3的I抗(1∶1 000)，4 ℃摇床孵育过夜，TBST洗涤3次，加入相应的II抗(1∶2 000，CST)室温孵育1 h，TBST洗涤3次，曝光。膜用TBST洗涤后，改用抗β-actin的I抗按相同的方法继续孵育，曝光。 所有Western blotting的 结果均用AlphaView 3.4.0.0进行灰度分析。

4 统计学处理

所有数据采用均数±标准差(mean±SD)表示，应用统计软件SPSS 13.0进行分析，各组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 类胰蛋白酶对IEC-6细胞生长的作用

Tryptase终浓度为1、10、100、1 000 μg/L时，IEC-6细胞的生存率分别为(98.0±7.8)%、(84.7±7.1)%、(56.5±14.9)%、(34.0±7.9)%。与对照组比，tryptase 100 μg/L组和1 000 μg/L组生存率均明显降低(P<0.05)，见图1。

2 类胰蛋白酶对IEC-6乳酸脱氢酶释放量的影响

10 μg/L tryptase组的LDH释放量为(360±48)U/L，100 μg/L组为(588±60)U/L，1 000 μg/L组为(659±46)U/L，后2组与对照组相比，均有明显升高(P<0.05)，见图2。

Figure 2.LDH release from IEC-6 cells after treatment with tryptase for 12 h. Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs 0 μg/L.

3 类胰蛋白酶对IEC-6细胞PAR-2蛋白表达的影响

与对照组相比，100 μg/L和1 000 μg/L tryptase浓度使得PAR-2的表达水平明显上升(P<0.05)，见图3。

Figure 3.The expression of PAR-2 in IEC-6 cells after treatment with tryptase for 12 h. Mean±SD. n= 3. *P<0.05 vs 0 μg/L.

4 PAR-2抑制剂FS 对类胰蛋白酶致IEC-6损伤的作用

1 000 μg/L tryptase 明显增加LDH的释放量、降低细胞生存率及显著增加cleaved-caspase 3的表达(P<0.05)。与1 000 μg/L tryptase组比较，使用400 μmol/L FS能够拮抗1 000 μg/L tryptase引起的上述指标改变(P<0.05)；与对照组比较，FS本身对上述3项指标均无影响，见图4、表1。

Figure 4.The expression of cleaved-caspase 3 in IEC-6 cells after treatment with tryptase (1 000 μg/L) and/ or FS(400 μmol/L).Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs tryptase group.

表1 各处理组细胞生存率、LDH释放量与对照组的比较

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vstryptase group.

讨 论

在小肠缺血-再灌注损伤期间，大量因素可导致肥大细胞激活并释放大量生物活性物质，包括组胺，5-羟色胺、肝素、趋化因子、过氧化物酶、类胰蛋白酶、胃促胰酶和羧肽酶等[6]。其中类胰蛋白酶具有广泛的生物学效应，不仅促进中性粒细胞聚集并释放炎症介质[7]，而且增加微血管通透性并促进新生血管形成[8]。Zhang 等[9]发现类胰蛋白酶促进的炎症细胞聚集及细胞凋亡在腹主动脉瘤形成的病理生理过程中起到主导作用。本研究结果同样发现随着类胰蛋白酶浓度升高，体外培养的大鼠小肠黏膜上皮细胞IEC-6的生长率逐渐降低、LDH的释放量逐渐增加、细胞凋亡增加，这些结果进一步证明，类胰蛋白酶具有对IEC-6细胞损伤作用，且具有浓度相关性，与既往研究报道类胰蛋白酶导致大肠黏膜细胞凋亡增加的结果一致[5]。

肥大细胞广泛分布于消化道黏膜下层结缔组织中的毛细血管及淋巴管周围，其类胰蛋白酶的释放是炎症性肠道疾病的主要发病因素[10]。在正常肠黏膜组织中，其类胰蛋白酶的浓度在8.0～154.6 μg/g之间，但在过敏性肠道疾病中，类胰蛋白酶浓度升高至525 μg/g左右[11]，因此，本研究选择类胰蛋白酶的量为1 μg/L～1 000 μg/L之间，远低于文献报道选用的12 mg/L[12]，研究结果进一步证实类胰蛋白酶在肠黏膜损伤中的关键作用。

目前已发现4种PAR受体(PAR-1、PAR-2、PAR-3和PAR-4)，其中PAR-2能特异性被类胰蛋白酶和胰蛋白酶(trypsin)激活，而其它的PAR受体则被凝血酶(thrombin)激活。PAR-2分布广泛，在胃肠道系统尤为丰富。现已经证明，PAR-2参与了多种疾病的发生发展。Antoniak等[13]发现，敲除PAR-2能减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤。McLarty 等[3]报道类胰蛋白酶/PAR-2信号通路是高血压状态下心肌纤维化的重要发病机制。也有人在体外证实，通过激活PAR-2受体可使HepG2细胞内Ca2+浓度升高、cyclinD mRNA表达上调，加速HepG2细胞周期进程，促进DNA合成，从而促进肝癌细胞的增殖[14]。王辉等[15]在研究炎性肠病大鼠模型中发现，其迷走神经背侧运动核中存在PAR- 1和 PAR- 2，它们激活后通过磷脂酶C和三磷酸肌醇通路参与进行调节钙离子内流。我们在前期研究中发现类胰蛋白酶抑制剂减轻小肠缺血-再灌注损伤并伴随着PAR- 2表达的下调[5, 16]。这种伴随现象使得我们有理由推测类胰蛋白酶/PAR-2 组成的信号通路可能在小肠缺血-再灌注损伤中起着关键作用。本体外细胞研究进一步发现，类胰蛋白酶刺激IEC-6细胞12 h后，PAR-2的表达上调，且与类胰蛋白酶浓度呈正相关。使用PAR-2的特异性抑制剂FSLLRY-NH2能逆转tryptase对IEC-6细胞的损伤作用，值得提出的是，本研究发现PAR-2抑制剂FSLLRY-NH2本身对IEC-6细胞无明显的生物学作用，与其在有类胰蛋白酶或者胰蛋白酶存在时，选择性地竞争性抑制PAR-2受体有关[17]。以上结果进一步证实类胰蛋白酶通过激活PAR-2受体，导致IEC-6细胞损伤。

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Role of PAR-2 in tryptase mediated IEC-6 cell injury

LI Shun1, HUANG Pin-jie1, GE Mian1, GAN Xiao-liang2

(1DepartmentofAnesthesiology,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China;2DepartmentofAnesthesiology,ZhongshanOphthalmicCentre,SunYat-senUniversity,Guangzhou510060,China.E-mail:ganxiaoliang@yeah.net)

AIM: To investigate the role of protease activated receptor-2 (PAR-2) in the process of tryptase mediated IEC-6 cell injury. METHODS: The rat intestinal epithelial cell line IEC-6 was treated with tryptase at different concentrations (1 μg/L, 10 μg/L, 100 μg/L and 1 000 μg/L) in the presence or absence of PAR-2 antagonist FSLLRY-NH2 for 12 h respectively. The cell survival rate was detected by MTT assay. The protein levels of PAR-2 and cleaved-caspase 3 were determined by Western blotting. The LDH activity was also measured. RESULTS: Compared with control group, the cell survival rates were significantly decreased in 100 μg/L and 1 000 μg/L tryptase treated groups, the LDH activities were significantly increased in 10 μg/L to 1 000 μg/L tryptase treated groups, and the protein levels of PAR-2 and cleaved caspase 3 were significantly increased in 100 μg/L and 1 000 μg/L tryptase treated groups (P<0.05). Compared with 1 000 μg/L tryptase treated group, the LDH activity and cleaved caspase 3 protein level were dramatically decreased while the survival rate was significantly increased in the presence of PAR-2 antagonist FSLLRY-NH2 (P<0.05). CONCLUSION: Tryptase induces IEC-6 cell injury in a dose-dependent manner by activating PAR-2.

Tryptase; Protease activated receptor-2; IEC-6 cells; Lactate dehydrogenase; Caspase 3

1000- 4718(2015)03- 0530- 04

2014- 08- 28

2014- 09- 28

广州市科技计划(No. 2014J4100172)；中山大学青年教师培育项目(No. 12ykpy37)

△通讯作者 Tel: 020-87331548; E-mail: ganxiaoliang@yeah.net

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.025