正交试验优选虎杖总黄酮的提取工艺

陈林莉，方继德，黎莉*

1.武汉工程大学化工与制药学院，湖北 武汉 430074；2.绿色化工过程教育部重点实验室（武汉工程大学），湖北 武汉 430074

正交试验优选虎杖总黄酮的提取工艺

陈林莉1，2，方继德1，2，黎莉1，2*

1.武汉工程大学化工与制药学院，湖北 武汉 430074；2.绿色化工过程教育部重点实验室（武汉工程大学），湖北 武汉 430074

为了比较虎杖总黄酮的超声法和冷浸法的提取效果，考察了乙醇质量分数、料液比、提取时间对虎杖总黄酮的影响，采用正交试验，分别对超声提取和冷浸提取虎杖总黄酮的工艺参数进行了优化.运用spss 19.0软件，对正交试验的数据进行了分析.结果表明，对虎杖总黄酮提取率影响最大的为料液比，乙醇质量分数和提取时间对其也有一定影响.虎杖中总黄酮最佳的提取工艺为乙醇质量分数80%，料液比1∶50，超声提取10m in.在该条件下，总黄酮提取率为19.31%.与冷浸法比较，超声法提取虎杖中总黄酮具有较高的提取率，对进一步开发利用虎杖中总黄酮具有一定的指导作用.

虎杖；总黄酮；正交试验；超声法

0 引言

虎杖为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根茎和根.我国大部分地区均产，主产于江苏、江西、山东、四川等地［1］.虎杖具有泻下、祛痰止咳、降压、止血、镇痛等药理作用，它的主要成分包括虎杖苷、黄酮类、大黄素、大黄素甲醚、白藜芦醇、多糖.据文献报道，黄酮类化合物具有抗氧化、调节心血管系统、镇痛、利胆保肝、调节内分泌系统等作用［2－3］.现代研究表明，黄酮类化合物具有良好的抗病毒作用［4－5］.本研究采用正交试验法，分别对超声法和冷浸法提取虎杖总黄酮的工艺参数进行了优化，同时对两种提取方法的效果作了比较，为虎杖总黄酮的进一步开发利用奠定了一定的实验基础.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；KQ－250型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DZF－6090真空干燥箱（上海琅玕实验设备有限公司）；高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）.虎杖购于武汉市传奇春天大药房，产地四川，经武汉工程大学黎莉教授鉴定为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根茎和根；芦丁对照品（供UV法测定，质量分数为92.6%，中国食品药品检定研究院，批号：100080－201409）；其余试剂均为分析纯.

1.2 正交试验设计

通过预实验，选定乙醇质量分数（A）、料液比（B）、提取时间（C）为考察因素，虎杖总黄酮含量为考察指标，按照L9（33）正交表设计，超声提取因素水平表见表1，冷浸提取因素水平表见表2.

表1 超声提取因素水平表Table 1 Factors and levels of ultrasonic extraction

表2 冷浸提取因素水平Table 2 Factors and levels of cold soak extraction

1.3 总黄酮含量测定

1.3.1 对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品21.6 mg，加少量质量分数60%乙醇溶解后置于100 mL容量瓶中并定容，摇匀，即得芦丁对照品溶液的质量浓度为0.2 mg·mL－1.

1.3.2 测定吸收波长的确定精密量取上述芦丁对照品溶液1mL，置于25mL容量瓶中，加蒸馏水至6mL，加质量分数5%NaNO2溶液1mL，充分摇匀后静置6min；加质量分数为10%A l（NO3）3溶液1mL，摇匀，静置6min；加质量分数4% NaOH溶液10mL，再加蒸馏水定容至刻度，摇匀后静置15min，以未加芦丁对照品试液作空白对照，于400~800 nm波长范围内进行光谱扫描，结果显示在500 nm处有最大吸收峰，故选择500 nm为测定波长.

1.3.3 标准曲线的绘制精密量取芦丁对照品溶液0、1、2、3、4、5、6m L，按照“1.3.2”步骤操作，以未加芦丁对照品的试液作空白对照，在500 nm处测吸光度，纵坐标为吸光度A，横坐标为芦丁质量浓度，绘制标准曲线，通过拟合得线性回归方程为：A＝12.282C－0.020 1，R2＝0.999 6.结果表明芦丁对照品在0.008～0.048mg·mL－1质量浓度范围内与吸光度线性关系良好.

1.3.4 供试品溶液的制备准确称取干燥过孔径0.425mm筛虎杖约1.00 g，按正交试验表中条件提取，提取液过滤后定容至100mL容量瓶中，即得供试品溶液.

1.3.5 样品含量测定精密量取上述供试品溶液0.5mL，按“1.3.3”项下方法测定吸光度，根据回归方程可计算总黄酮含量.

1.4 方法学考察

1.4.1 精密度试验精密量取同一供试品溶液6份，每份0.5 mL，分别置于25 mL容量瓶中，按“1.2.3”项下方法测定吸光度.结果，RSD＝1.456%，表明该方法有较好的精密度.

1.4.2 稳定性试验精密量取供试品溶液0.5mL，置于25 mL容量瓶中，按“1.3.3”项下方法每隔5 min测定一次吸光度，共测6次.结果，RSD＝1.185%，表明样品的稳定性良好.

1.4.3 重复性试验平行制备6份供试品溶液，按“1.3.3”项下方法测定吸光度.结果，RSD＝1.857%，表明该方法重复性较好.

1.4.4 加样回收率试验精密量取已知含量的供试品溶液6份，每份0.25mL，分别精密加入一定量的芦丁对照品溶液，按“1.3.3”项下方法测定吸光度.结果，平均回收率为99.208%，RSD＝0.988%，表明该方法回收率高.

2 结果与讨论

2.1 正交试验结果及分析

正交试验结果见表3，方差分析结果见表4.

由表3和表4得出，超声法中RB＞RA＞RC，表明影响总黄酮提取率的因素顺序为料液比＞乙醇质量分数＞提取时间.可知对总黄酮提取率的影响较大的是料液比、乙醇质量分数，提取时间对总黄酮提取率的影响较小，但由于试验次数较少，均未见显著性差异.因此，超声法最佳提取工艺为A3B3C1，即乙醇质量分数80%，料液比1∶50，提取时间10 min.

冷浸法中RB＞RA＞RC，表明影响总黄酮提取率的因素顺序为料液比＞乙醇质量分数＞提取时间.可知对总黄酮提取率的影响较大的因素为乙醇质量分数、料液比，提取时间对总黄酮提取率的影响较小，但由于试验次数较少，均未见显著性差异.因此，冷浸法最佳提取工艺为A3B3C2，即乙醇质量分数80%，料液比1∶50，提取时间24 h.

由上述实验结果可知，超声法和冷浸法对总黄酮提取率的影响因素相似.但超声法提取效果优于冷浸法，且超声提取时间较短，故虎杖总黄酮的最佳提取工艺为：乙醇质量分数80%、料液比为1∶50、超声提取10min.

2.2 验证试验

准确称取干燥虎杖（过孔径0.425 mm筛）约1.00 g，按超声法最佳提取工艺A3B3C1平行操作3次，其总黄酮平均提取率为19.31%，RSD＝1.16%.验证试验结果与正交试验结果基本一致，表明该提取工艺稳定可行.

表3 正交试验结果Table 3 Results of orthogonal experiment

表4 方差分析结果Table 4 Results of variance analysis

3 结语

本实验通过正交试验分别考察了虎杖总黄酮的超声法和冷浸法提取提取工艺，比较两种总黄酮提取的工艺可以看出，超声法提取效果优于冷浸法，并获得虎杖总黄酮的最佳提取工艺为：乙醇质量分数80%、料液比1∶50、超声提取10 min.在该条件下，总黄酮提取率为19.31%.本实验优选的虎杖中总黄酮的提取工艺操作简单、提取率高，并为虎杖中总黄酮的后续开发研究提供了一定的实验基础.

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GAO Xue－min.Chinese m edicine［M］.Beijing：China Press of Traditional Chinese Medicine，2007.（in Chinese）

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Optim izing extraction technology of total flavonoids from Polygonum cuspidatum by orthogonal experiment

CHEN Lin－li1，2，FANG Ji－de1，2，LI Li1，2
1.School of C hemical Engineering and Pharmacy，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430074，China；2.Key Laboratory for Green Chemical Process ofMinistry of Education，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430074，China

To compare the extraction rates between the ultrasonic method and the cold soak method of total flavonoids from Polygonum cuspidatum，the effects of ethanol concentration，solid-liquid ratio and extraction time on the extraction rateswere explored.And the technological parameters of the ultrasonic method and the cold soakmethod were optimized by orthogonal experiment.Using software spss 19.0，the data of the orthogonal experiment were analyzed.The results show that the effect of solid－liquid ratio on the extraction rates of total flavonoids from Polygonum cuspidatum is the biggest，followed by the ethanol concentration and the extraction time.The optimal extraction conditions are ethanol concentration of 80%，solid－liquid ratio of 1∶50 and ultrasonic extraction of 10 min.Under the condition，the extraction rate of total flavonoids is 19.31%.Compared with the cold soak method，the ultrasonic method has a higher extraction rate，which is helpful to the further development and use of total flavonoids in Polygonum cuspidatum.

Polygonum cuspidatum；total flavonoids；orthogonal experiment；ultrasonic method

TB35

A

10.3969/j.issn.1674-2869.2015.12.002

1674－2869（2015）12－0006－04

本文编辑：张瑞

2015－11－02

武汉工程大学研究生教育创新基金（CX2014022）

陈林莉（1991－），女，湖北黄冈人，硕士研究生.研究方向：中药活性成分及制剂.*通信联系人