利用一测多评法同时测定栀子中6种成分含量

苗琦　罗扬婧　方文娟　等

摘要：以栀子中的6种成分为指标，建立其他指标成分与栀子苷的相对校正因子 ，计算各成分的含量，实现一测多评；同时采用回归方程法测定该6种成分含量，并比较2种方法所得计算值与实测值的差异，以验证一测多评法的准确性和可行性。结果表明：12批栀子中6种成分的计算值与实测值间无显著差异，利用一测多评法控制栀子的质量是准确可行的。

关键词：一测多评；校正因子；HPLC；栀子

中图分类号： R284.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0292-03

收稿日期：2014-09-28

基金项目：国家科技支撑计划（编号：2011BAI04B01）；中央本级重大增减支项目（编号：20603020110、20603020213）；江西中医药大学校级研究生创新专项（编号：JZYC14C09）。

作者简介：苗琦（1989—），男，陕西宝鸡人，硕士研究生，主要从事中药资源开发与应用研究。E-mail：miaoqi6213963@126.com。

通信作者：罗光明，博士，教授，主要从事中药资源开发与应用研究。Tel：（0791）7118982；E-mail：jzlgm11@163.com。中药多成分定量和多指标质量控制中存在的对照品缺乏问题，是目前中药多指标质量控制和评价模式的主要瓶颈之一。仅以1种有效成分含量无法客观反映中药材的质量，在中药材对照品紧缺、价格高昂的背景下，为了能采用多指标客观反映中药材质量，王智民等率先提出了一测多评法（quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS）的中药质量评价新模式，该法通过测定中药材中固有成分含量，按照相对校正因子推算该药材中其他成分含量[1]。QAMS采用仅测定1种价廉、易得的成分含量，实现多成分同步测定的模式，克服了多指标质量控制面临的对照品短缺和高昂检测成本问题。虽然目前该方法已被成功应用于木通、黄连、人参等 20 种常用中药的质量评价研究[2-4]，但是该方法在栀子（Gardeniae）药材中的应用还鲜有报道。本研究探索了QAMS 技术在栀子质量评价中应用的可行性，旨在为栀子质量评价提供新途径。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

仪器：Waters 2695 separations module型高效液相色谱仪（Waters 2996 photodiode array detector 检测器、Waters empower 化学工作站，美国Waters公司）；Agilent 1200型高效液相色谱系统，Agilent 1260型高效液相色谱系统；BP224S型电子天平（Sartorius公司）；KQ-300E型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）。

试剂：甲醇（色谱纯，美国TEDIA公司）；乙腈（色谱纯，美国ACS公司）；甲醇（分析纯，西陇化工股份有限公司）；水（娃哈哈牌）；对照品：京尼平苷酸（编号111828-201102，纯度按96.0%计算）、绿原酸（编号110753-201314，纯度按96.6%计算）、栀子苷（编号110749-201316，纯度按97.5%计算）、西红花苷-Ⅰ（编号111588-201202，纯度按91.1%计算）、西红花苷-Ⅱ（编号111589-201304，纯度按92.4%计算）购于中国药品生物制品检定所，京尼平1-β-D龙胆二糖苷（批号为ZM0501BA14，纯度>98.0%）购于上海源叶生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1原理在一定线性范围内，成分的量（浓度，C）与检测器响应（峰面积，A）呈正比[5]。在进行多成分（s， a，b，…，i，…）质量评价时，用中药材中某一有效成分（廉价、易得）作为内参物（s），建立内参物与其他成分（a，b，…，i，…）间的相对校正因子RCF（fsa，fsb，fsc，…）， 计算公式为：

fsi=fs/fi=（As/Cs）/（Ai/Ci）

式中：As为内参物对照品s的峰面积；Cs为内参物对照品s的浓度；Ai为某待测成分对照品i的峰面积；Ci为某待测成分对照品i的浓度。

1.2.2色谱条件Durashell C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）；梯度洗脱：0～18 min（8%～15% A），18～25 min（15%～23% A），25～40 min（23%～35% A），40～50 min（35%～50% A）；检测波长：238、330、440 nm；柱温30 ℃；流速0.8 mL/min；进样量10 μL。

1.2.3供试品溶液的制备称取供试品粉末（过四号筛）约0.1 g，置具塞锥形瓶中，加入75%甲醇25 mL，称质量，超声处理40 min（笔者前期分别考察了50%、60%、75%、100%甲醇作为提取溶剂进行超声提取，发现采用75%甲醇超声提取40 min条件下提取率高，因此本研究选用75%甲醇超声提取40 min作为提取条件），冷却后再称质量，用甲醇补足减失质量，摇匀，滤过。量取续滤液10 mL，置25 mL量瓶中，加75%甲醇至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过即得。

1.2.4对照溶液的制备称取各对照品适量，分别置于 50 mL 棕色量瓶中，用适量75%甲醇溶液溶解并定容至刻度，分别制成含京尼平苷酸10.176 μg/mL、京尼平1-β-D龙胆二糖苷201.292 μg/mL、绿原酸4.444 μg/mL、栀子苷311610 μg/mL、西红花苷-Ⅰ 175.276 μg/mL、西红花苷-Ⅱ 17.371 μg/mL的1#对照品储备液，备用。

2结果与分析endprint

2.1一测多评法的检测结果

2.1.1线性范围将1#混合对照品储备液，分别用75%甲醇稀释2、4、8、16、32、64倍，作为2#～7#混合对照品溶液，备用。按照上述色谱条件进行测定，进样10 μL，以进样量 10 μL 中对照品质量为横坐标，最佳检测波长下的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得京尼平苷酸、京尼平1-β-D龙胆二糖苷、绿原酸、栀子苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ的标准曲线。由表1可见，各化合物在相应范围内线性关系良好。

2.1.2相对校正因子的计算以栀子苷为内参物，分别计算京尼平苷酸、京尼平1-β-D龙胆二糖苷、绿原酸、西红花

表1对照品质量与峰面积的线性关系

对照品名称标准曲线相关系数

（r）线性范围

（μg）京尼平苷酸京尼平1-β-

D龙胆二糖苷绿原酸栀子苷西红花苷-Ⅰ西红花苷-Ⅱy=1 610 765x-95y=1 144 290x-1 123y=4 025 629x+744y=1 859 824x+117y=7 633 873x+10 739y=8 706 055x-5760.999 90.999 90.999 70.999 90.999 90.999 90.001 59～0.101 760.031 45～2.012 920.000 69～0.044 440.048 68～3.116 100.027 38～1.752 760.002 71～0.173 71

苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ的相对校正因子。由表2可见，除绿原酸/栀子苷的RSD较大以外（原因可能是绿原酸含量较低，峰面积小，检测误差大导致），其他对照品相对校正因子的RSD均小于1%。表2各对照品的相对校正因子

编号f京尼平苷酸/栀子苷f京尼平1-β-D龙胆二糖苷/栀子苷f绿原酸/栀子苷f西红花苷-Ⅰ/栀子苷f西红花苷-Ⅱ/栀子苷1#1.153 91.624 60.461 10.243 90.213 52#1.163 01.632 20.459 50.241 30.214 43#1.152 71.633 40.435 30.241 70.214 14#1.156 91.625 60.435 80.242 10.215 65#1.167 91.635 60.447 00.244 00.213 76#1.179 41.628 20.442 00.246 70.211 87#1.154 01.636 90.536 00.244 70.210 0平均值1.161 11.630 90.459 50.243 50.213 3RSD0.84%0.30%7.68%0.78%0.86%

2.1.3精密度试验取2#混合对照品溶液10 μL，在上述色谱条件下连续进样5次，测定峰面积。结果表明，栀子苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ、绿原酸、京尼平1-β-D龙胆二糖苷、京尼平苷酸的RSD分别为0.55%、0.50%、0.41%、048、0.49%、0.54%，表明仪器精密度良好。

2.1.4稳定性试验取2#混合对照品溶液，分别于样品制备后0、2、4、8、12、24 h进样10 μL，测峰面积。结果表明，栀子苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅰ、绿原酸、京尼平1-β-D龙胆二糖苷、京尼平苷酸的RSD分别为1.21%、1.33%、097%、1.74%、1.51%、1.82%，表明供试品溶液在1 d内稳定。

2.1.5重复性试验取同一药材，按上述方法制成供试品溶液5份，测峰面积。结果表明，栀子苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ、绿原酸、京尼平1-β-D龙胆二糖苷、京尼平苷酸的RSD分别为1.36%、1.89%、0.59%、1.30%、0.77%、143%，表明该方法重复性良好。

2.1.6加样回收率试验称取已知含量的样品5份，加入 2 mL 混合对照品溶液，按照本研究方法制备供试品溶液，按照上述色谱条件进样10 μL，测定6种有效成分的峰面积，并计算平均加样回收率。结果表明，平均回收率分别为9932%、99.48%、99.19%、99.34%、99.51%、99.65%，表明该方法回收率较好。

2.2校正因子的重现性考察

2.2.1色谱柱及高效液相色谱仪考察取1#～7#混合对照品溶液，分别进样10 μL，计算京尼平苷酸、京尼平1-β-D龙胆二糖苷、绿原酸、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ的相对校正因子。并考察Waters 2695-2996、Agilent 1200、Agilent 1 260 等3种高效液相色谱系统和Promosil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Durashell C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）等3种色谱柱下的相对校正因子。由表3中的RSD值可知，不同仪器及不同色谱柱下的相对校正因子差异并不明显。表3不同仪器和色谱柱条件下测得的相对校正因子

仪器色谱柱相对校正因子f京尼平苷酸/栀子苷f京尼平1-β-D龙胆二糖苷/栀子苷f绿原酸/栀子苷f西红花苷-Ⅰ/栀子苷f西红花苷-Ⅱ/栀子苷Waters2695Durashell C181.161 11.630 90.459 50.243 50.213 3Promosil C181.157 81.612 40.450 30.240 60.216 6Diamonsil C181.160 41.643 70.463 90.246 20.210 9Agilent1200Durashell C181.159 01.628 30.472 70.239 10.215 1Agilent1260Durashell C181.158 41.632 10.441 20.242 20.214 7平均值1.159 31.629 50.457 50.242 30.214 1RSD0.12%0.69%2.66%1.13%1.00%endprint

2.2.2不同试验条件对比用同一色谱柱Durashell C18（46 mm×250 mm，5 μm），在2个实验室进行一测多评方法的试验。结果表明，除实验室1中绿原酸/栀子苷差异较大外，其他相对校正因子差异较小，RSD小于1.5%（表4）。表4不同试验条件下测得的校正因子

编号f京尼平苷酸/栀子苷f京尼平1-β-D龙胆二糖苷/栀子苷f绿原酸/栀子苷f西红花苷-Ⅰ/栀子苷f西红花苷-Ⅱ/栀子苷实验室1实验室2实验室1实验室2实验室1实验室2实验室1实验室2实验室1实验室21#1.153 91.143 91.624 61.611 60.461 10.453 10.243 90.252 10.213 50.209 12#1.163 01.149 51.632 21.620 10.459 50.454 50.241 30.251 40.214 40.205 63#1.152 71.146 61.633 41.617 70.435 30.458 10.241 70.258 30.214 10.211 14#1.156 91.147 11.625 61.614 30.435 80.457 00.242 10.257 00.215 60.206 85#1.167 91.143 31.635 61.616 50.447 00.456 30.244 00.257 30.213 70.208 66#1.179 41.145 01.628 21.618 40.442 00.459 20.246 70.250 80.211 80.210 27#1.154 01.143 61.636 91.617 20.536 00.452 70.244 70.254 90.210 00.213 5平均值1.161 11.145 61.630 91.616 50.459 50.455 80.243 50.254 50.213 30.209 2RSD0.84%0.20%0.30%0.17%7.68%0.55%0.78%1.22%0.86%1.27%

2.2.3待测色谱峰定位对于其他待测指标成分峰的定位，普遍采用相对保留时间的定位方法，本试验利用峰的相对保留时间进行定位。试验发现，不同液相系统、色谱柱相对保留时间的RSD均小于5%（表5），由此可知，通过相对保留时间进行峰定位是可行的。表5不同仪器、色谱柱下的相对校正因子

仪器色谱柱相对校正因子r京尼平苷酸/栀子苷r京尼平1-β-D龙胆二糖苷/栀子苷r绿原酸/栀子苷r西红花苷-Ⅰ/栀子苷r西红花苷-Ⅱ/栀子苷Waters2695Durashell C180.378 20.771 60.831 11.609 31.756 8Promosil C180.360 30.803 20.880 91.620 61.798 9Diamonsil C180.374 40.799 70.858 31.647 31.813 1Agilent1200Durashell C180.364 30.755 30.806 91.552 81.706 2Agilent1260Durashell C180.367 40.756 30.845 61.678 21.902 4Mean0.3689 20.777 220.8445 61.621 641.795 4RSD1.98%2.97%3.30%2.88%4.06%

2.3一测多评法与回归方程法测定结果的比较

按照供试品溶液处理方法制备了12批栀子药材样品，分别吸取各供试品溶液10 μL注入高效液相色谱仪测定。分别采用回归方程法和一测多评法测定栀子药材中京尼平苷酸、京尼平1-β-D龙胆二糖苷、绿原酸、栀子苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ含量，结果见表 6。对2种方法所测含量值进行了t检验，结果显示，2种方法所得栀子药材含量不存在显著差异（P>0. 05），且2种方法所得的含量值偏差都在3%以内，说明一测多评法用于栀子药材的多成分质量评价是可行的。表6一测多评法和回归方程法测得栀子药材中各组分含量比较

样品

编号组分含量（μg/g）京尼平苷酸京尼平1-β-D龙胆二糖苷绿原酸西红花苷-Ⅰ西红花苷-Ⅱ回归方程法QAMS回归方程法QAMS回归方程法QAMS回归方程法QAMS回归方程法QAMS13 408.83 424.06 467.86 428.0715.1695.88 513.58 596.2964.3958.622 608.82 619.56 676.46 637.3805.1781.97 700.57 783.6829.0823.53245.5243.13 596.53 547.0140.5145.610 306.510 387.81 109.11 103.14225.4222.94 739.64 693.9141.4146.510 410.510 491.81 647.11 640.35211.0208.54 903.44 858.198.4105.39 910.49 991.91 614.01 607.26375.3373.76 164.06 123.1107.8114.311 041.311 122.31 610.31 603.67279.4277.38 351.68 318.31 020.1987.911 916.911 997.8904.8899.28395.5393.98 766.08 733.5150.9155.57 661.87 744.61 652.91 646.19660.8660.77 299.77 261.7150.4155.05 670.35 754.01 143.51 137.410262.9260.74 386.04 339.1103.3110.07 788.57 871.4913.3907.611300.6298.63 966.73 918.5492.9483.010 502.310 583.81 314.71 308.412232.3229.94 400.34 353.535.945.48 309.28 392.0917.9912.3endprint

3讨论

栀子具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒等功效。栀子果实的化学成分主要包括环烯醚萜苷类、二萜类（西红花苷类）、有机酸酯类及其他类化学成分[6]。其中栀子苷具有抗炎、解热、利胆、轻泻作用；京尼平苷酸具有抗肿瘤和抗氧化作

用；有文献报道，京尼平1-β-D龙胆二糖苷能改善戊巴比妥钠引起的心力衰竭；绿原酸为栀子中主要有机酸酯类成分，具有显著的抗癌作用及保肝利胆作用；西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ是西红花、栀子中共有的色素类成分，具有去黄疸、利胆及明显的降血脂作用[7]。本研究通过一测多评的分析方法对栀子药材中6种成分进行测定，为栀子药材中活性成分的多成分、多指标质量控制提供了新模式。

环烯醚萜类化合物是已知栀子药材中的有效成分，238 nm 为京尼平苷酸、栀子苷、京尼平1-β-D龙胆二糖苷的最大吸收波长，330 nm为酚酸类物质绿原酸常用检测波长，440 nm为西红花苷类化合物西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ最佳检测波长，因此选用238、330、440 nm为检测上述6种成分的波长。

通过比较一测多评法和传统回归方程法所得栀子6种成分含量值，发现两者之间并没有显著差异，且不同实验室、仪器、色谱柱下各有效成分间的校正因子重现性良好，说明在对照品不足的情况下，将一测多评用于栀子中药材多指标质量评价与质量控制是可行的，该方法具有一定的发展前景。

参考文献：

[1]王智民，高慧敏，付雪涛，等. “一测多评”法中药质量评价模式方法学研究[J]. 中国中药杂志，2006，31（23）：1925-1928.

[2]朱晶晶，王智民，匡艳辉，等. 一测多评法同步测定人参和三七药材中多种人参皂苷的含量[J]. 药学学报，2008，43（12）：1211-1216.

[3]匡艳辉，朱晶晶，王智民，等. 一测多评法测定黄连中小檗碱、巴马汀、黄连碱、表小檗碱、药根碱含量[J]. 中国药学杂志，2009，44（5）：390-394.

[4]朱晶晶，王智民，张启伟，等. 一测多评法同时测定黄芩药材中4种黄酮类成分的含量[J]. 中国中药杂志，2009，34（24）：3229-3234.

[5]王智民，钱忠直，张启伟，等. 一测多评法建立的技术指南[J]. 中国中药杂志，2011，36（6）：656-658.

[6]杨全军，范明松，孙兆林，等. 栀子化学成分、药理作用及体内过程研究进展[J]. 中国现代中药，2010，12（9）：7-12.

[7]孟祥乐，李红伟，李颜，等. 栀子化学成分及其药理作用研究进展[J]. 中国新药杂志，2011，20（11）：959-967.凌敏，杨秀莲，王良桂. 四唑染色法测定巨紫荆种子生活力[J]. 江苏农业科学，2015，43（1）：295-297.endprint