百蕊草根系总RNA提取方法比较及优化

刘波　张晓明　郭巧生　等

摘要：百蕊草根系富含多糖、多酚和其他次生代谢产物，用传统方法提取总RNA难以有效将这些杂质去除。以百蕊草根系为材料，比较TRIzol法、CTAB-LiCl法、SDS/酚法及改进TRIzol法4种方法对百蕊草根系总RNA的提取效果，并以电泳检测、D260 nm/D280 nm比值测定、RT-PCR试验等对结果进行分析评价。结果表明，4种方法均能提取百蕊草根中总RNA，提取效果差异显著；改进TRIzol法提取总RNA的28S和18S条带清晰，无弥散，28S亮度比18S加倍，完整性好，无明显DNA或其他杂质污染，D260 nm/D280 nm值为1.8～2.0，D260 nm/D230 nm值大于2.0，总RNA得率仅次于TRIzol法；用改进TRIzol法提取总RNA，反转录cDNA片段大小分布在0.2～2.5 kb，可扩增出目的基因片段，提取的总RNA完全适用于后续的分子生物学研究。

关键词：百蕊草；总RNA提取；多糖；多酚；TRIzol法；RT-PCR

中图分类号： Q522文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0044-03

收稿日期：2014-03-25

基金项目：国家自然科学基金（编号：81202867）。

作者简介：刘波（1989—），男，浙江衢州人，硕士，主要从事药用植物栽培生理研究。E-mail：2011104175@njau.edu.cn。

通信作者：郭巧生，博士，教授，主要从事药用植物资源开发。E-mail：gqs@njau.edu.cn。百蕊草（Thesium chinense Turcz.）为檀香科百蕊草属半寄生植物，全草入药，具有清热解毒、止咳化痰等功效[1]，被称为植物抗生素[2]，具有重要的药用价值。百蕊草根系可形成寄生根侵入寄主植物[3-4]，通过寄生根从寄主植物获得水分和养分。目前，对百蕊草的研究主要集中在药理成分、提取工艺、组织培养等方面[2，5-9]，在分子水平上的研究较少，至今未见有关百蕊草根系总RNA提取方面的报道。

植物组织RNA的提取是开展后续植物分子生物学研究的必要前提。进行RT-PCR、cDNA合成、Northern印迹杂交、SSH筛选差异基因等分子生物学相关研究，均需要完整性好、纯度高的RNA。因此，如何提高RNA纯度和经济快捷获得足够量的RNA是当前研究人员十分关注的问题。百蕊草根系化学成分复杂，富含多糖及酚类物质[10]。酚类化合物容易氧化产生褐化效应[11]，在RNA提取过程中与RNA不可逆结合，导致RNA降解或RNA活性丧失[12]；多糖能与RNA共沉淀形成难溶的胶状物，抑制许多酶的活性[13]。为此，本试验开展TRIzol法、CTAB-LiCl法、SDS/酚法[14-16]、优化改进TRIzol法提取百蕊草根系总RNA研究，以期筛选出一种理想的百蕊草根系RNA提取方法，为今后利用分子生物学研究百蕊草寄生机理提供技术参考。

1材料与方法

1.1试验材料

野生百蕊草采集于南京市附近，选挖长势良好的植株，清洗根系，立即投入液氮中冷冻保存，备用。原植物经南京农业大学郭巧生教授鉴定为檀香科植物百蕊草。

1.2总RNA提取方法

1.2.1TRIzol法取0.1 g植物组织，在液氮中研磨至粉末状后转移到1.5 mL离心管中；加入1 mL预冷的TRIzol，涡旋混匀，室温放置5 min；加入200 μL氯仿，振荡1 min，室温放置15 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min；吸取上层水相至新离心管中，加入500 μL预冷的异丙醇，振荡混匀，室温放置 10 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min；弃上清，加入1 mL 75%乙醇，振荡，使沉淀浮起，悬浮1 min，4 ℃、7 500 r/min离心5 min；弃置上清，空气中干燥5 min，加入50 μL ddH2O溶解，-70 ℃保存。

1.2.2CTAB-LiCl法将2×CTAB 提取液于65 ℃水浴锅中预热；取0.2 g样品于液氮中研磨成粉末，转入2 mL离心管中，加700 μL提取液和20 μL β-巯基乙醇，剧烈振荡混匀；65 ℃水浴10 min，其间振荡数次，冷却到室温后加等体积比例为25 ∶24 ∶1的苯酚、氯仿、异戊醇混合液，充分振荡，冰浴10 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min；取上清至2 mL新离心管中，重复上述步骤，再抽提1次；取上清于1.5 mL离心管中，加入1/4体积的10 mol/L LiCl溶液，4 ℃过夜，4 ℃、12 000 r/min 离心20 min；弃上清，沉淀用500 μL ddH2O溶解，加等体积比例为24 ∶1的氯仿、异戊醇溶液再抽提1次，4 ℃、12 000 r/min离心10 min；上清液中加入1/10体积、pH值为52、浓度3 mol/L的乙酸钠和等体积预冷的异丙醇，-20 ℃ 沉淀3 h，4 ℃、12 000 r/min离心10 min；弃上清，用75%乙醇清洗沉淀，室温干燥，ddH2O溶解，-70 ℃保存。

1.2.3SDS/酚法取0.2 g样品于液氮中研磨成粉末，加入80 ℃预热的提取缓冲液850 μL；加入PVP和β-巯基乙醇，充分混匀，冰浴15 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min；上清液中加入1/3体积、pH值为4.8、浓度为5 mol/L的乙酸钾，冰浴15 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min；上清液中加入等体积、比例为24 ∶1的氯仿、异戊醇溶液，充分混匀，冰浴 10 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min；上清液中加入等体积预冷异丙醇，-20 ℃放置3 h，4 ℃、12 000 r/min离心15 min；弃上清液，用600 μL重悬缓冲液重悬沉淀，4 ℃、12 000 r/min离心15 min；75%乙醇清洗沉淀，室温干燥，ddH2O溶解，-70 ℃ 保存。

1.2.4改进TRIzol法在TRIzol法基础上，在加入TRIzol试剂的同时，加入20 μL β-巯基乙醇，用异丙醇沉淀后，加入500 μL ddH2O溶解沉淀，加入1/4体积的10 mol/L LiCl溶液，-20 ℃下静置6 h，4 ℃、12 000 r/min离心20 min；弃上清，沉淀用500 μL ddH2O溶解，加等体积比例为24 ∶1的氯仿、异戊醇溶液再抽提1次，4 ℃、12 000 r/min离心10 min；取上清，加1/10体积pH值为5.2、浓度为3 mol/L的乙酸钠和等体积预冷的异丙醇，-20 ℃沉淀3 h，4 ℃、12 000 r/min离心10 min；弃上清，用75%乙醇清洗沉淀，室温干燥，ddH2O溶解，-70 ℃保存。

1.3总RNA质量检测

1.3.1总RNA完整性检测分别取由4种总RNA提取方法获得的百蕊草根系总RNA，在1.2%非变性琼脂糖凝胶上电泳检测，3次重复。

1.3.2总RNA纯度及得率检测用紫外分光光度计测定所提取RNA样品的D230 nm、D260 nm、D280 nm值，计算D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm，评价总RNA纯度；同时，测定总RNA浓度并计算得率。

1.4改进TRIzol法提取总RNA完整性的RT-PCR检验

cDNA第1链的合成参照Thermo Scientific公司RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit操作说明书进行。采用25 μL PCR反应体系：1 μL逆转录产物， 1 μLTcActin正向引物：5′-ACCACTGCTGAGCGGGAAA-3′， 1 μL反向引物：5′-CTGCAATGCCAGGGAACA-3′，15.3 μL 灭菌ddH2O， 2.5 μL 10×PCR buffer，2 μL 25 mmol/L MgCl2 ，2 μL 2.5 mmol/L dNTP ，0.2 μL Taq DNA聚合酶。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，28个循环；72 ℃延伸5 min。反应完毕后取5 μL于1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。

2结果与分析

2.1不同提取方法对总RNA完整性的影响

由图1可见，4种方法提取的总RNA完整性和基因组DNA残留程度有较大差异；TRIzol法提取的RNA电泳条带清晰，可见28S、18S、5S条带，且28S的亮度较18S高，RNA完整性较好，但靠近电泳点样孔附近有亮斑，可能存在蛋白质、糖类等杂质残留；CTAB-LiCl法提取的RNA电泳呈弥散分布，28S和18S处略微可见且亮度较高，但条带不够清晰，这说明此方法提取的RNA已经有所降解，提取的RNA中可能存在基因组DNA；SDS/酚法提取的RNA电泳弥散最为严重，存在基因组DNA残留；改进的TRIzol法提取的RNA电泳可见清晰的28S和18S条带，且28S比18S亮度加倍，且完整性好，提取的RNA样品中无明显基因组DNA残留。

2.2不同提取方法的总RNA纯度和得率

D260 nm/D280 nm和D260 nm/D230 nm是对提取的核酸纯度和产率进行定量分析的通用方法，高纯度的RNA溶液D260 nm/D280 nm应介于1.8～2.0之间，D260 nm/D230 nm应大于2.0。由表

1可见，TRIzol法提取的RNA溶液D260 nm/D280 nm仅为1.582，可能存在蛋白质和酚等有机物残留，纯度过低；CTAB-LiCl法、SDS/酚法、改进TRIzol法D260 nm/D280 nm分别为2.081、2223、1.943，均有效去除了蛋白质和酚等物质；CTAB-LiCl法和改进TRIzol法D260 nm/D230 nm均大于2.0，即对酚类和糖类等有机物质可以有效去除；4种方法中，RNA提取产率最高的为TRIzol法，而CTAB-LiCl法、SDS/酚法、改进TRIzol法提取RNA的产率与TRIzol法相比，依次约能达到TRIzol法的70.3%、43.6%、73.1%。

表1不同方法提取百蕊草根系总RNA纯度及得率

提取方法D260 nm/D280 nmD260 nm/D230 nm得率

（μg/g）TRIzol法1.582±0.0481.082±0.070189.073±3.963CTAB-LiCl法2.081±0.0592.332±0.015132.983±2.455SDS/酚法2.223±0.0261.793±0.00782.367±9.166改进TRIzol法1.943±0.0492.074±0.033138.168±5.498

2.3改进TRIzol法提取总RNA的完整性验证

以改进TRIzol法提取的总RNA为模板进行反转录，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，可看出反转录的cDNA片段呈弥散分布，大小主要集中分布在0.2～2.5 kb（图2）。该结果基本吻合植物RNA长度的一般范围，反映该cDNA的模板mRNA比较完整，提取的RNA质量较高，可以满足后续分子生物学试验要求。

对百蕊草TcActin基因保守区序列进行RT-PCR扩增，以进一步验证改进方法提取RNA的完整性。由图3可见，百蕊草TcActin基因保守区序列能得到片段长度约为330 bp的扩增产物，PCR产物经测序长度为333 bp，扩增片段长度与预计的檀香科Actin基因保守区序列长度一致，这说明改进的TRIzol方法提取总RNA保持了表达基因的完整性。

3讨论

纯度高、完整性好的RNA是进行分子克隆及基因表达分析的基础[17]。近年来，关于植物RNA提取方法的报道逐渐增多[18-20]。由于多数植物材料成分复杂，特别是糖类和酚类等有机物质对RNA提取的干扰很大[21-22]。酚类物质容易氧化形成褐化效应，与RNA不可逆结合，严重降低了RNA的质量和产率；含有多糖的RNA沉淀难溶于水，即使通过加热等方式溶解，溶液也呈黏稠状。目前，去除多糖的方法主要有高浓度NaCl沉淀法、LiCl沉淀法、乙酸钾沉淀法等。

TRIzol试剂原本用于提取动物组织RNA，因其操作步骤简便，全程只需1～2 h，后被开发提取植物组织RNA，且对多种植物组织RNA的提取十分有效[18]。较高浓度的CTAB不仅对植物细胞具有良好的裂解作用，有效形成核蛋白与核酸的复合物，而且还能与β-巯基乙醇联合作用使蛋白变性，抑制RNA酶的活性[23]。CTAB作为阳离子表面活性剂成分，从富含多糖、多酚材料中分离出高质量RNA已经在多种植物材料中得到验证。

传统TRIzol法提取的百蕊草根系总RNA沉淀呈褐色，且很难溶于水中，稍加热溶解沉淀后有淡黄色的膜状物质，不能有效去除酚类和糖类物质，但是通过凝胶电泳检测发现，TRIzol法提取的总RNA完整性良好，对RNA酶的抑制能力强，可有效避免降解；CTAB-LiCl法获得的RNA沉淀沾水即溶，结合凝胶电泳及OD值测定，该方法可有效去除蛋白质、酚类、糖类等有机物质，但存在基因组DNA污染，且不能有效抑制RNA酶的活性，出现RNA降解，这意味着提取的失败。

结合TRIzol法能够有效抑制RNA酶活性和CTAB-LiCl法能有效去除蛋白质、酚类、糖类等有机物质的特点，优化百蕊草根系总RNA提取方法，形成改进的TRIzol法，即在提取时加入β-巯基乙醇，该物质不仅能打开蛋白酶的二硫键使酶失活，从而抑制酚类氧化酶和RNA酶的活性，也能与酚类产生竞争性氧化，可有效避免褐化现象[24]。另外，LiCl沉淀可去除部分多糖，多次的酚/氯仿抽提也基本去除了蛋白质、酚类、糖类等有机物质。改进TRIzol法提取总RNA，虽然RNA的得率有所降低，但获得的RNA质量高，可以满足后续的分子生物学试验。

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