芍药苷预处理激活AMPKα对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

高宇勤，郝霁萍，赵国平

(1.西安市第九医院心血管内科，陕西 西安 710054；2.暨南大学医学院中西医结合系，广东 广州 510632)

·论 著·

芍药苷预处理激活AMPKα对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

高宇勤1，郝霁萍1，赵国平2

(1.西安市第九医院心血管内科，陕西 西安 710054；2.暨南大学医学院中西医结合系，广东 广州 510632)

目的 探究芍药苷预处理激活AMPKα信号通路对大鼠在体心肌缺血再灌注损伤的保护作用。方法本实验共用SPF级雄性SD大鼠30只，分三组，分别为假手术组、缺血再灌注组、药物预处理组，采用结扎SD大鼠心脏LAD的方法建立在体大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，利用0.5%Evan's蓝灌注心肌，1%氯化三苯基四氮唑(TTC)磷酸缓冲液孵育心肌，CK-MB试剂盒来观察心肌缺血、坏死及肌酸磷酸激酶(CK-MB)和HE染色观察心肌损伤程度，利用蛋白印迹(Western blot)技术探究芍药苷预处理对腺苷酸活化蛋白激酶(AMPKα)的影响。结果芍药苷药物预处理组与缺血再灌注组比较，药物预处理组心梗面积较缺血再灌注组明显减小(P＜0.01)；CK-MB检测也发现药物预处理组与缺血再灌注组比较能明显降低CK-MB值(P＜0.01)；HE染色发现药物预处理组较缺血再灌注组能明显减轻大鼠心肌局灶性肿胀、心肌间质水肿，减少炎性细胞浸润及血管充血；蛋白印迹实验发现药物预处理组能明显促进AMPKα蛋白的表达，升高磷酸化AMPKα的表达。结论芍药苷预处理能减轻大鼠在体心肌缺血再灌注损伤，可能通过增加AMPKα蛋白的表达，促进AMPKα磷酸化而实现。

芍药苷；心肌缺血再灌注损伤；腺苷酸活化蛋白激酶

缺血预处理能明显减轻心肌缺血再灌注损伤的程度，是一种有效的内源性保护机制[1]。但是缺血预处理在临床实践中因为伦理和操作的不现实难以执行。因此探索用药物来代替缺血预处理，即药物模拟缺血预处理就成为研究的热点，目前有大量研究也证实许多模拟性药物预处理及后处理确实具有类似缺血预处理的保护作用[2-4]。芍药苷(Paeoniflorin)是单萜糖苷类化合物，是毛茛科植物芍药干燥根中的一种生物活性成分。有研究发现芍药苷对脑缺血损伤具有保护作用[5-6]，但是对于心肌缺血再灌注损伤研究较少，特别是在体研究方面尤为缺乏。本实验采用在体大鼠冠状动脉前降支(LAD)结扎术模型来观察芍药苷预处理对心肌保护作用及其与腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路的关系。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 芍药苷购于南京泽朗医药科技有限公司(批号ZL20090409SYG)，抗pAMPKα (Thr172，兔抗鼠一抗)和AMPKα抗体购于美国细胞信号(Cell Signaling)生物技术公司；其余皆为国产试剂。

1.2 建立动物模型 SPF级雄性SD大鼠30只，体重280～400 g，由广东省医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(粤)2008-0002。大鼠称重后注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)，麻醉后固定大鼠仰卧于手术台，剪除颈部和胸部被毛，碘伏消毒，纵形剪开颈部皮肤长1.5～2.0 cm，分离皮下组织及肌肉，显露气管及甲状腺，于甲状腺后方钝性分离气管并带线，提起丝线，剪刀于气管环之间剪开气管半周，气管插管，接呼吸机，调整呼吸频率60次/min、通气量20 ml/kg。于胸骨左缘3 mm处纵形剪开胸部皮肤长约4 cm，钝性分离皮下组织、胸大肌与前锯肌，撑开胸大肌及前锯肌，显露肋骨及肋间肌，于第三肋间隙逐步剪开肋间肌，显露胸膜，于呼气时大镊子刺破胸膜，进入胸腔，撑开肋骨，撕破心包，显露心脏，探查确定左心耳，确定缝扎位置(肺动脉圆锥与左心耳交界处下方2 mm，前降支LAD近端位置)，用0#线，叠一个0.8～1.0 mm的凹槽硅胶管，出针打结结扎LAD，缺血30 min，松开结扎，复灌2 h。模型复制的可靠性用ECGⅡ导联的变化来判断，以ST段抬高为心肌缺血存在，以ST段回落1/2为再灌注成功(见图1)。本实验建模时共计有3只SD大鼠因为麻醉和手术原因死亡，死亡率为10%。

1.3 分组及给药方案 芍药苷与生理盐水混合，于灌胃前加热溶解混均，药物预处理组大鼠给予芍药苷100 mg/kg灌胃，一天灌胃一次，连续灌胃4 d，最后一次于手术前30 min给予。30只雄性SD大鼠(体重280～400 g)被随机分为三组，每组10只，每组中5只进行心梗面积及缺血面积测定，另外5只进行其他指标测定，三组分别为假手术组(此组只开胸，但不结扎LAD)、缺血再灌注组和药物预处理组。

1.4 心肌梗死面积测定 实验终点时暴露心脏，原位结扎左冠状动脉主干，经主动脉逆行灌注(压力为80 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa)0.5%Evan's蓝2～3 ml，立即取出心脏，以预冷生理盐水冲洗残余血液，将左室与其他心肌组织分离，快速置于液氮中，随即取出冷冻心脏，沿左室长轴方向连续环切，每片2～3 mm。正常心肌组织为蓝色，缺血区心肌组织为粉色，分离无蓝染缺血区和蓝染非缺血区，滤纸吸干，分别称重，缺血面积为无蓝染缺血区重量与无蓝染缺血区和蓝染非缺血区重量之和之比。然后将无蓝染缺血心肌置入1%氯化三苯基四氮唑(TTC)磷酸缓冲液(pH 7.4)中，在37℃下孵育20 min，此时坏死区(NZ)呈灰白色，非坏死区(NNZ)呈深红色，然后将NZ和NNZ分离，滤纸吸干，置于电子天平上称重。梗死面积由坏死心肌重量与缺血心肌重量(坏死区与非坏死区之和)之比表示。

1.5 心肌组织HE染色 再灌注结束后迅速剪下心脏，置于冰缓冲液中洗净，分离左心室前壁缺血区，切取3～5 mm3组织，置于10%中性甲醛固定12 h，脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡、染色及中性树胶封片，镜下观察心肌病理形态。

1.6 蛋白印迹(Western blot)检测 配制10%分离胶，5%浓缩胶，上液蛋白总量120 μg，进行电泳。转膜条件：AMPKα蛋白检测用350 mA恒流湿转45 min；一抗孵育条件：anti-pAMPKα(1:500)、anti-AMPKα (1:1 000)、Anti-GAPDH(1:2 000)，4℃孵育过夜，二抗(1:5 000)。将Western blot ECL发光液A、B各500 μl等量混合后涂在PVDF膜上，覆盖胶片，于暗房中曝光，扫描仪扫描Western blot图像，Quantity one软件分析Western blot条带的灰度值。

1.7 肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)检测 按照试剂盒检测说明书操作。

1.8 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，检验水准α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 大鼠心肌缺血再灌注损伤模型建立成功的心电图表现

2 结果

2.1 芍药苷预处理对心肌梗死面积及CK-MB的影响 本实验利用0.5%Evan's蓝灌注心肌、1%TTC磷酸缓冲液孵育心肌、CK-MB试剂盒分别观察心肌缺血、坏死面积及CK-MB的变化。结果表明，药物预处理组与缺血再灌注组比较，前者较后者心梗面积明显减小，差异有显著统计学意义(P＜0.01)；利用CK-MB检测发现药物预处理组较缺血再灌注组能明显降低CK-MB值，差异有显著统计学意义(P＜0.01)，见表1。

表1 芍药苷预处理对心肌梗死面积及CK-MB的影响(±s)

表1 芍药苷预处理对心肌梗死面积及CK-MB的影响(±s)

注：药物预处理组与缺血再灌注组比较，aP＜0.01。

假手术组缺血再灌注组药物预处理组886.53±54.46 4367.37±879.52 1912.74±249.14a555 0.58±0.02 0.61±0.03 0.59±0.02 0.00±0.00 0.37±0.07 0.14±0.05a

2.2 芍药苷预处理对心肌组织病理形态的影响 本实验利用HE染色观察芍药苷预处理对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤心肌病理形态的影响(见图2)。假手术组大鼠心肌纤维排列整齐、染色均匀、结构清晰，心肌无萎缩、肥大或坏死，也无炎细胞浸润等病理形态改变，心肌细胞染色清晰、形态完整、横纹清晰、细胞核致密，未见细胞水样变性等病理改变；缺血再灌注组大鼠心肌损伤明显，心肌纤维排列紊乱，不均匀嗜伊红染色增强，心肌间质水肿，组织间隙明显增宽，血管扩张、充血、出血等，心肌细胞多处肿胀、溶解断裂，横纹不清或消失，心肌细胞发生空泡样变性等，细胞核肿胀甚至销蚀、脱失；而药物预处理组的心肌损伤较缺血再灌注组的心肌损伤程度轻，在药物预处理组中心肌纤维结构尚完整，可见局灶性轻度肿胀，嗜伊红染色增强，心肌间质轻度水肿，组织间隙轻度增宽，可见少量炎细胞浸润，血管略充血，心肌细胞排列尚整齐，部分核染色呈深染改变。从组织病理学提示芍药苷预处理可以减轻缺血再灌注损伤程度。

图2 芍药苷预处理心肌组织病理的影响(×200)

2.3 芍药苷预处理对大鼠心肌AMPKα的影响 本实验采用蛋白印迹(Western blot)技术观察芍药苷预处理对大鼠心肌AMPKα信号通路的影响。实验结果显示：药物预处理组能促进AMPKα蛋白的表达，与缺血再灌注组比较差异有显著统计学意义(P＜0.01)；药物预处理组能升高磷酸化pAMPKα的表达，与缺血再灌注组比较差异亦有统计学意义(P＜0.05)。上述结果说明芍药苷预处理能明显增加AMPKα蛋白的表达，而且能促进AMPKα磷酸化，见图3。

图3 芍药苷预处理对大鼠心肌AMPKα的影响

3 讨论

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是一种重要的酶促能量平衡和调控的信号通路[7]，担任细胞内能量感应器的作用。AMPK是一个由α、β、γ 3个亚基构成的异三聚体蛋白，α亚基起催化作用，α亚单位中的数个位点(苏氨酸172、苏氨酸258、丝氨酸485等)均可被磷酸化，其中苏氨酸172位点被磷酸化在AMPK活性的调节中起重要作用。目前研究发现，AMPK信号通路与心肌缺血再灌注损伤(MIRI)有密切的关系，当AMPK活化后，首先可以抑制心肌细胞凋亡，保护心脏功能。有研究发现，AMPK活性被长期抑制的转基因小鼠其心脏功能正常，无心肌肥大或心肌纤维化，但在低流量缺血和缺血再灌注后，与野生型鼠比较，转基因鼠心功能恢复受损，心肌损伤程度加重，Caspase2、3活性增加，心肌细胞凋亡增加[8]。也有研究[9]发现，脂联素可以减少MIRI心肌细胞凋亡，其抗凋亡作用就是通过AMPK的活化来实现的。有研究发现，AMPK活化后具有抗炎作用。AMPK的活化抑制了缺血后白细胞和内皮细胞之间的粘附，减少炎症细胞的局部聚集，从而发挥抗炎作用。由于AMPK活化后具有抗凋亡、抗炎等作用[9]，因此通过干预AMPK信号通路来发挥心肌保护作用是目前研究的一个热点，也是一个创新点。

芍药苷是单萜糖苷类化合物，是毛茛科植物芍药干燥根中的一种生物活性成分。有研究发现芍药苷对脑缺血损伤具有保护作用[5-6]，但是对于心肌缺血再灌注损伤研究较少。有研究发现芍药苷预处理可以清除氧自由基从而保护心肌细胞膜和细胞器膜免受氧化应激损伤，同时能减轻细胞内钙超载，保护心肌细胞免受再灌注损伤[10]；芍药苷[11]还可降低BAX及Caspase-3的表达，上调BCL-2的表达，减少心肌细胞凋亡及心肌梗死面积，干预MIRI，但是对于AMPK信号通路的影响未见相关研究，而且上述研究结论都是通过离体实验获得的。

本实验采用了结扎SD大鼠心脏LDA的方法建立在体大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，此模型能更真实体现药物的药理学作用。实验中发现药物预处理组能明显减少心梗面积(与缺血再灌注组比较，P＜0.01)；肌酸磷酸激酶(CK-MB)检测亦证实芍药苷预处理能减轻心肌损伤程度(与缺血再灌注组比较，P＜0.01)。从组织学形态观察亦发现芍药苷药物预处理能明显减轻大鼠心肌局灶性肿胀、心肌间质轻度水肿，减少炎性细胞浸润、血管充血。本实验利用蛋白印迹(Western blot)技术观察芍药苷预处理对大鼠心肌AMPKα信号通路的影响，发现药物预处理组能促进AMPKα蛋白的表达，能促进磷酸化pAMPKα的表达，结果说明芍药苷预处理减轻缺血再灌注损伤是部分通过增加AMPKα蛋白的表达，促进AMPKα磷酸化而实现。

[1]Montero MF,Saurim R,Bonservizi WG,et al.Heart injury following intestinal ischemia reperfusion in rats is attenuated by association of ischemic preconditioning and adenosine[J].Acta Cir Bras, 2014,29(Suppl 2):67-71.

[2]Efthymiou CA,Mocanu MM,Yellon DM.Atorvastatin and myocardial reperfusion injury:new pleiotropic effect implicating multiple prosurvival signaling[J].J Cardiovasc Pharmacol,2005,45(3): 247-252.

[3]Bell RM,Clark JE,Hearse DJ,et al.Reperfusion kinase phosphorylation isessential but not suff i cient in the mediation of pharmacological preconditioning:characterisation in the biphasic prof i le of early and late protection[J].Cardiovasc Res,2007,73:153-163.

[4]Liu LF,Qin Q,Qian ZH,et al.Protective effects of melatonin on ischemia-reperfusion induced myocardial damage and hemodynamic recovery in rats[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2014,18(23): 3681-3686.

[5]Li XF,Wen ZB,He XF,et al.Effects of Cinnamic acid on expression of Tissue factor induced by TNFα in endothelial cells and its mechanisms[J].J Chin MedAssoc,2006,69(5):207-212.

[6]王君萍,韦颖梅,郭 梅,等.芍药苷对大鼠脑缺血再灌注损伤细胞凋亡相关基因的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志,2008,6 (3):310-312.

[7]Bouma HR,Ketelaar ME,Yard BA,et al.AMP-activated protein kinase as a target for preconditioning in transplantation medicine[J]. Transplantation,2010,21(6):560-568.

[8]Hao J,Kim HS,Choi W,et al.Mechanical stretch-induced protection againstmyocardialischemia-reperfusion injury involves AMP-activated protein kinase[J].Korean J Physiol Pharmacol, 2010,14(1):1-9.

[9]汪 俊,邵名亮,曹 蘅,等.脂联素对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用[J],中华心血管病杂志,2010,38(3):752-758.

[10]刘旭春,韦颖梅.芍药苷预处理对大鼠离体缺血再灌注损伤心脏的保护作用[J].中西医结合心脑血管病杂志,2009,7(10): 1177-1179.

[11]Nizamutdinova IT,Jin YC,Kim JS,et al.Paeonol and paeoniflorin, the main active principles of Paeonia albiflora,protect the heart from myocardial ischemia/reperfusion injury inrats[J].Planta Med, 2008,74(1):576-584.

Protective effects of pretreatment with paeoniflorin on the myocardial ischemia reperfusion injury of rats in vivo by activating AMPK α.

GAO Yu-qin1,HAO Ji-ping1,ZHAO Guo-ping2.
1.Department of Cardiovascular Medicine,the Ninth Affiliated Hospital of Xi'an,Xi'an 710054,Shaanxi,CHINA;2.Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,College of Medicine,Jinan University,Guangzhou 510632,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo explore the protective effects of pretreatment with paeoniflorin on the myocardial ischemia reperfusion injury of rats in vivo by activating AMPKα.MethodsThe SPF grade male SD rats(30 rats) were divided into three groups:sham operation group[the rats'chests were opened,but the left anterior descending coronary arteries(LAD)were not ligated],ischemia reperfusion group and paeoniflorin pretreatment group,each with 10 cases.Myocardial ischemia reperfusion injury model was established by cardiac LAD ligation in SD rats.The degree of myocardial injury was observed by HE staining and perfusion of 0.5%Evan's blue and 1%triphenyl tetrazolium chloride(TTC).Western blot was used to explore the effects of paeoniflorin pretreatment on AMPKα.ResultsIn comparison with ischemic reperfusion group,paeoniflorin pretreatment could decrease infarction area significantly(P＜0.01)and reduce the value of creatine phosphokinase(CK-MB)significantly(P＜0.01).HE staining showed paeoniflorin pretreatment could significantly relieve myocardial focal swelling,intermyocardial swelling,inflammatory cell infiltration,and vascular engorgement.Western blot showed that paeoniflorin pretreatment could increase the expression of AMPKα and promote the phosphorylation of AMPKα.ConclusionPretreatment with paeoniflorin could relieve myocardial ischemia reperfusion injury of rats in vivo.The effect is probably achieved by increasing the expression of AMPKα and promoting phosphorylation ofAMPK α.

Paeoniflorin;Myocardium ischemia reperfusion injury;AMP-activated protein kinase alpha (AMPK α)

R-332

A

1003—6350（2015）15—2185—05

2015-03-23)

国家自然科学基金（编号：81173189）；西安市卫生局科技项目及西安市科技项目（编号：SF1416）

郝霁萍。E-mail：gaoyuqin1234567@aliyun.com